哈茨木霉幾丁質(zhì)酶V基因等克隆及其特性研究.pdf

1、在當(dāng)今世界大力倡導(dǎo)可持續(xù)發(fā)展的大環(huán)境下，可持續(xù)發(fā)展思想及環(huán)保意識(shí)提高了生物防治技術(shù)的重要性，受到了國(guó)際社會(huì)的極大關(guān)注。構(gòu)建出高效、廣譜及價(jià)格低廉的生物農(nóng)藥來(lái)替代化學(xué)農(nóng)藥，最低限度的減少環(huán)境污染，達(dá)到綠色生產(chǎn)、綠色環(huán)保的目的。
　　哈茨木霉（Trichoderma harzianum）是一種優(yōu)良的生物防治真菌，在植物病害，尤其是土壤傳染病害的生物防治中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。哈茨木霉主要通過(guò)重寄生作用、溶菌作用、抗生素作用、蛋白酶作用以

2、及對(duì)空間和營(yíng)養(yǎng)的競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制達(dá)到防治植物病原菌的目的。在各種惡劣的生存條件下哈茨木霉的抑菌功能受到了極大限制和破壞，限制了其生防潛力的進(jìn)一步發(fā)揮。因而，提高哈茨木霉的防治效果，及保證其在逆境條件下生防功能順利實(shí)現(xiàn)具有重要的意義。
　　為增強(qiáng)哈茨木霉防治效果和對(duì)外界抵抗能力，利用真菌表達(dá)載體pBI121， pCAMBIA1301和克隆載體pUC18，成功構(gòu)建了用于根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化表達(dá)載體pCA-GChiⅤ和pCA-GSO

3、D。以潮霉素抗性基因?yàn)檫x擇標(biāo)記，目的基因的啟動(dòng)子為CaMV35S，兩種載體分別含有幾丁質(zhì)酶（ChiⅤ）基因、超氧化物岐化酶（SOD）基因。對(duì)影響哈茨木霉轉(zhuǎn)化的因素進(jìn)行優(yōu)化，獲得了該系統(tǒng)轉(zhuǎn)化哈茨木霉的最佳條件。經(jīng)過(guò)潮霉素抗性選擇培養(yǎng)，Southern雜交，RT-PCR及傳代分析得到穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子。采用與三種植物病原菌室內(nèi)拮抗實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)重組ChiⅤ和SOD后的哈茨木霉轉(zhuǎn)化子的抑菌活性。結(jié)果表明通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)所獲得轉(zhuǎn)ChiⅤ哈

4、茨木霉轉(zhuǎn)化子具有良好的抑菌活性，對(duì)植物病原菌都表現(xiàn)出很強(qiáng)的拮抗作用。通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)所獲得SOD哈茨木霉轉(zhuǎn)化子保持了哈茨木霉菌的抑菌活性，對(duì)哈茨木霉原菌和SOD哈茨木霉轉(zhuǎn)化子進(jìn)行高溫和鹽脅迫實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了比較，結(jié)果證實(shí)，哈茨木霉原菌在逆境下不能正常存活；而SOD木霉轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化后的哈茨木霉菌，在逆境下仍能正常存活，且對(duì)植物病原菌仍具備良好的拮抗作用。
　　ChiⅤ基因在哈茨木霉中的表達(dá)，明顯提高了哈茨木霉的抑菌能力。SOD基

5、因在哈茨木霉中的表達(dá)，提高了哈茨木霉對(duì)高溫和高鹽的抗逆性，保證了哈茨木霉能夠在高溫和高鹽的條件下發(fā)揮其生防功能。從而，為哈茨木霉的抑菌功能在更廣泛的領(lǐng)域中應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　在獲得的哈茨木霉（T. harzianum）EST序列基礎(chǔ)上，為提高哈茨木霉菌抗外界干擾能力，克隆了與抗堿性鹽和干旱相關(guān)的sod和hsp24基因的DNA序列，克隆獲得的這些序列已在GenBank上注冊(cè)。將克隆得到的sod和hsp24基因構(gòu)建原核表達(dá)載體pET

6、-sod、pET-hsp24，通過(guò)雙酶切、測(cè)序檢測(cè)證明重組載體構(gòu)建成功。通過(guò)IPTG誘導(dǎo)使sod、hsp24基因在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21中表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)分別獲得15.7kD、24.0kD的蛋白帶，蛋白大小與預(yù)期相符，說(shuō)明它們已經(jīng)在大腸桿菌（E. coli）中表達(dá)，并檢測(cè)了sod蛋白粗酶活和hsp24的耐熱功能，證明了哈茨木霉（T. harzianum）基因能夠在原核生物中良好表達(dá)。
　　為

7、提高哈茨木霉菌（T. harzianum）的sod和hsp24基因表達(dá)效率，我們將sod和hsp24基因構(gòu)建到帶有高效啟動(dòng)子的釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）表達(dá)載體pYES2上，并轉(zhuǎn)入釀酒酵母（S. cerevisiae）INVSc1細(xì)胞，得到了攜帶sod、hsp24外源基因的酵母轉(zhuǎn)化子。逆境脅迫實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)sod、hsp24基因酵母對(duì)Na2CO3和干旱的耐受能力明顯提高，表明sod、hsp24基因與哈茨木

8、霉（T. harzianum）的抗逆境脅迫相關(guān)，這對(duì)研究哈茨木霉（T. harzianum）在自然界常見(jiàn)逆境下的生物防治能力具有重要意義。
　　以上基因的克隆和功能研究為哈茨木霉（T. harzianum）其它功能基因的克隆和研究建立了完善的技術(shù)平臺(tái)，對(duì)哈茨木霉（T. harzianum）重要生物防治基因的進(jìn)一步發(fā)掘和利用具有重要意義。同時(shí)，將幾丁質(zhì)酶基因和超氧化物歧化酶基因分別轉(zhuǎn)化到哈茨木霉（T. harzianum）中并表達(dá)，