葡萄應(yīng)答銅脅迫的分子機(jī)理研究.pdf

1、銅(Cu)是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素，在植物光合作用、呼吸作用、氧化脅迫、激素應(yīng)激和細(xì)胞壁代謝等眾多生理過(guò)程中扮演重要角色。但過(guò)量的銅對(duì)植物是十分有害的，可以導(dǎo)致大量活性氧自由基的產(chǎn)生，誘導(dǎo)DNA損傷、蛋白質(zhì)氧化、膜質(zhì)過(guò)氧化等，進(jìn)而影響植物一系列生化反應(yīng)和生理過(guò)程。葡萄(Vitis vinifera L.)是世界性的重要果樹，也是我國(guó)最為重要的經(jīng)濟(jì)果樹之一。隨著含銅殺菌劑在葡萄生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用，葡萄銅脅迫逐漸成為影響葡萄生產(chǎn)的重

2、要挑戰(zhàn)。本研究通過(guò)分析葡萄組培苗在銅脅迫下的生長(zhǎng)、生理及銅平衡相關(guān)基因的分子反應(yīng)，初步了解葡萄耐銅的生理和分子機(jī)理。在此基礎(chǔ)上，利用高通量測(cè)序技術(shù)在轉(zhuǎn)錄組水平和miRNA調(diào)控水平全面分析葡萄應(yīng)答銅脅迫的基因和miRNA，通過(guò)轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證表明葡萄miR398靶基因CSD2能提高植株耐銅性，為在分子水平更全面地揭示葡萄耐銅機(jī)理提供了理論基礎(chǔ)。最后對(duì)葡萄響應(yīng)銅脅迫的保守miRNA不同家族成員的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，了解葡萄miRNA家族成員的

3、多元化表達(dá)以及發(fā)現(xiàn)起關(guān)鍵作用的成員，有利于我們更好的認(rèn)識(shí)葡萄miRNA的調(diào)節(jié)作用。主要研究結(jié)論如下:
　　1.銅脅迫對(duì)葡萄組培苗生理指標(biāo)及銅平衡相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　采用組培法，研究葡萄在不同濃度銅處理下的反應(yīng)。結(jié)果表明:高銅和低銅脅迫均能抑制根的生長(zhǎng)，且高銅抑制更加明顯。在高銅脅迫下，葡萄根和葉片中銅離子含量迅速增加，丙二醛(MDA)的含量也隨之升高，而超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)

4、酶活性增加來(lái)保護(hù)植物免受銅脅迫傷害。分析了19個(gè)涉及銅代謝平衡調(diào)節(jié)相關(guān)的銅轉(zhuǎn)運(yùn)體(CTr)，分子伴侶(Chaperones)和P-型ATP酶(P-type ATPases)的編碼基因在根和葉中的表達(dá)模式。研究結(jié)果表明，銅轉(zhuǎn)運(yùn)體CTr1、CTr2和CTr8在銅過(guò)量和缺乏條件下均表達(dá)上升，ZIP2在銅過(guò)量時(shí)表達(dá)下調(diào)，在銅缺失時(shí)表達(dá)上升，而ZIP4在相同條件下與ZIP2有相反的表達(dá)模式。進(jìn)一步銅分子伴侶和P型ATP酶編碼基因也在不同程度上應(yīng)答

5、外界銅濃度的變化。
　　2.葡萄銅脅迫的轉(zhuǎn)錄組分析
　　本研究采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)從全基因組水平分析了葡萄對(duì)銅吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、耐性與解毒相關(guān)的基因表達(dá)與調(diào)控的分子機(jī)制。共產(chǎn)生了23，257個(gè)轉(zhuǎn)錄本，其中19，414個(gè)轉(zhuǎn)錄本沒有明顯的差異表達(dá)，3，843個(gè)轉(zhuǎn)錄本有明顯的差異表達(dá)，其中包括1，892個(gè)上調(diào)基因和1，951個(gè)下調(diào)基因。在這項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)了很多已知的和新的 Cu誘導(dǎo)或抑制基因。生物學(xué)分析表明，銅脅迫能抑制

6、葡萄葉綠素的代謝和光合作用。銅脅迫下，抗氧化酶、熱激蛋白、病程相關(guān)蛋白及次級(jí)代謝產(chǎn)物等ROS清除系統(tǒng)均被強(qiáng)烈誘導(dǎo)。在激素信號(hào)中，脫落酸在銅脅迫下表現(xiàn)出負(fù)調(diào)控作用，而乙烯、生長(zhǎng)素、茉莉酸和油菜素內(nèi)酯均表現(xiàn)出正調(diào)控作用等。本研究也鑒定了一系列編碼銅轉(zhuǎn)運(yùn)體、P1B型ATP酶、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、MATE轉(zhuǎn)錄因子的基因?？傮w而言，本研究首次從全基因組水平分析了葡萄銅脅迫應(yīng)答基因，并為全面理解葡萄應(yīng)答銅脅迫的代謝調(diào)控機(jī)制提供線索。
　　3.葡萄

7、銅脅迫響應(yīng)microRNAs的識(shí)別、鑒定與靶基因CSD2功能驗(yàn)證
　　本研究構(gòu)建了銅脅迫處理和清水處理（對(duì)照）兩個(gè)miRNA文庫(kù)。通過(guò)小RNA高通量測(cè)序共鑒定了158條保守miRNAs和98條新miRNAs，在保守miRNAs中，95條miRNAs在銅脅迫下表達(dá)下調(diào)，有4條miRNAs在銅脅迫下表達(dá)上調(diào);在新鑒定的miRNAs中，35條miRNAs在銅脅迫下表達(dá)下調(diào)，12條miRNAs在銅脅迫下表達(dá)上調(diào)。在保守miRNA中，miR

8、398在銅脅迫下表達(dá)下調(diào)最為顯著，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和RLM-RACE分析表明葡萄miR398能介導(dǎo)CSD2裂解，通過(guò)轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證，表明在煙草中過(guò)表達(dá)葡萄CSD2能提高植株耐銅性。該研究為深入了解葡萄miRNAs響應(yīng)銅脅迫的分子機(jī)理研究提供了理論基礎(chǔ)。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組和小RNA兩個(gè)調(diào)控水平數(shù)據(jù)的結(jié)合分析，為分子水平揭示葡萄耐銅機(jī)理和抗性育種提供了理論依據(jù)。
　　4.葡萄miRNA不同家族成員的表達(dá)模式分析
　　miRNA屬于多基因

9、家族，并且家族成員間僅相差一個(gè)或數(shù)個(gè)堿基，會(huì)造成其與靶基因匹配程度和調(diào)控強(qiáng)度的變化。本研究采用qRT-PCR和miR-RACE研究了8個(gè)響應(yīng)銅脅迫的葡萄miRNA(miR398、miR159、miR164、miR167、miR172、miR319、miR393和miR396)和它們的家族成員在不同組織和不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式。結(jié)果表明，Vv-miRNAs的表達(dá)水平在葡萄發(fā)育過(guò)程中是動(dòng)態(tài)變化的;同一Vv-miRNA家族不同成員的表達(dá)也存在