玉米苗期漬水脅迫誘導根系miRNA快速應答機理的研究.pdf

1、玉米是全世界最重要的糧食、飼料和能源作物之一，也是我國第一大糧食作物。澇漬是影響熱帶、亞熱帶地區(qū)玉米生產(chǎn)，尤其是苗期土壤漬水，已成為制約我國南方地區(qū)發(fā)展玉米生產(chǎn)的非生物逆境脅迫因素之一。真核生物基因組內(nèi)存在大量非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)基因，它們在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上，直接參與發(fā)育基因和對非生物逆境脅迫應答基因的表達調(diào)控。
　　 本研究選用苗期具有不同耐漬表型的自交系Hz32(高耐漬性)、Mo17(漬

2、害敏感)和B73(中等耐性)為研究材料，分別對三葉期沙培幼苗進行漬水1h、2h、4h的短期漬水脅迫處理，分析對照與各處理條件下根系miRNA的表達動態(tài)、鑒定特異表達miRNA的順式作用元件及受其負調(diào)控的靶基因，旨在揭示玉米苗期在漬水逆境條件下，低氧脅迫誘導根系miRNA快速應答的調(diào)控機理，為闡明玉米苗期耐漬性的分子機制，為采用分子標記輔助選擇策略，選育具有優(yōu)良耐漬性的玉米自交系提供理論依據(jù)。研究工作取得了以下結果：
　　 1.從

3、高耐漬系Hz32經(jīng)4小時漬水處理和對照的根組織樣本中，分離所有小分子RNA(small RNA，smRNA)，采用高通量RNA測序技術建立了smRNA文庫。分別從處理樣品中獲得了9，251，451個reads，從對照樣品中獲得了9，541，782個reads。經(jīng)歸并整理，從這兩個文庫中共鑒定了24個與耐漬相關的差異表達miRNA序列(代表著64個已知的miRNA基因和2個新miRNA基因)。
　　 2.采用qPCR技術，對Hz3

4、2、B73、Mo17三個自交系的1h，2h，4h漬水處理與對照根組織樣本，進行上述24個miRNA及其靶基因的表達動態(tài)分析。結果表明：24個miRNA介入了92個候選靶基因的表達調(diào)控。其中的miR159、miR164、miR167、miR393、miR408和miR528可能為主要參與根系發(fā)育和漬水脅迫響應的miRNA。
　　 3.對自交系Hz32經(jīng)4h漬水處理及對照樣本的RNA-seq分析，驗證了大部分miRNA靶基因的表達。

5、而且采用5’-RLM-RACE方法，驗證了其中6個靶基因的miRNA剪切位點。對miRNA與其靶基因表達動態(tài)進行了相關分析，表明：約有50%的靶基因與其miRNA的表達量呈負相關，其中多數(shù)為參與低氧脅迫響應的轉(zhuǎn)錄因子。揭示了miRNA作為轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控機制中的關鍵因子，在玉米苗期耐漬脅迫響應中發(fā)揮著重要作用。
　　 4.利用JASPAR(http：//jasper.genereg.net/)數(shù)據(jù)庫中的順式元件位置權重矩陣(PWM

6、，Position Weight Matrix)對具有轉(zhuǎn)錄起始位點(Transcription StartSite，TSS)信息的30個差異表達的miRNA，進行啟動子區(qū)的順式作用元件(cis-motif)分析，共鑒定到18個與低氧脅迫響應及發(fā)育相關的順式作用元件。同時利用本研究構建的，含有712個擬南芥轉(zhuǎn)錄因子(Transcription Factor，TF)的TF文庫進行酵母單雜交(Yeast One Hybrid，Y1H)的鑒定，