番茄類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因(CCD7、CCD8)的克隆表達(dá)及功能研究.pdf

1、目的：寄生性雜草列當(dāng)在新疆廣泛存在，對(duì)當(dāng)?shù)丶庸し?、甜瓜、西瓜、向日葵等重要?jīng)濟(jì)作物均造成了嚴(yán)重?fù)p失。為了有效防治列當(dāng)危害，本研究對(duì)列當(dāng)種子萌發(fā)刺激物獨(dú)腳金內(nèi)酯合成相關(guān)基因類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因片段進(jìn)行克隆、表達(dá)及功能驗(yàn)證來明確其在列當(dāng)與寄主之間相互識(shí)別過程中所起的作用。進(jìn)而再利用RNA沉默技術(shù)來研究其對(duì)番茄獨(dú)腳金內(nèi)酯產(chǎn)生的影響，為培育抗列當(dāng)品種做好技術(shù)儲(chǔ)備。
　　方法：根據(jù)根據(jù) Genbank中已經(jīng)報(bào)道的番茄類胡蘿卜素裂解雙

2、加氧酶7（CCD7）和類胡蘿卜素裂解雙加氧酶8（CCD8）基因序列信息，設(shè)計(jì)特異性引物克隆番茄CCD7和CCD8目的基因片段。采用RNAi技術(shù)，設(shè)計(jì)對(duì)番茄CCD7和CCD8基因特異性的RNA沉默載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)入番茄中，建立番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系。收集不同沉默的番茄植株根系分泌物，采用高效液相色譜質(zhì)譜法（HPLC-MS）分離、純化，測(cè)定獨(dú)腳金內(nèi)酯的含量及其對(duì)列當(dāng)種子萌發(fā)的影響，驗(yàn)證CCD7和CCD8基因在獨(dú)腳金內(nèi)酯合成中的功能

3、。
　　結(jié)果：1、利用Trzol法從番茄根系中提取總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù) GenBank公布的番茄CCD7和CCD8基因系列設(shè)計(jì)引物7-F、7-R和8-F、8-R，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，分別擴(kuò)增出大小為400bp的CCD7和CCD8基因片段。經(jīng)菌液PCR和測(cè)序鑒定，測(cè)序后與模板序列比對(duì)結(jié)果顯示相似度>90％。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果顯示，克隆得到的基因序列分別與 Solanum lycopersicum的CCD

4、7、CCD8聚在同一個(gè)分支上，同源性非常高，表明克隆得到的目的片段序列正確。
　　2、通過StuⅠ和SalⅠ雙酶切pMD18-T-7和pMD18-T-8質(zhì)粒，將CCD7和CCD8基因片段進(jìn)行拼接，連接轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和SalⅠ雙酶切pMD18-T-7+8，獲得大小為800bp的串聯(lián)片段CCD7+8。選用pUCCRNAi為中間載體，利用酶切方式將串聯(lián)片段CCD7+8插入到中間載體上，構(gòu)建含有Intro在內(nèi)的反向

5、重復(fù)序列結(jié)構(gòu)，最后將其連入植物表達(dá)載體p35中，將連接體系轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株 DH5α。提取抗性菌落的質(zhì)粒，用PstⅠ酶切質(zhì)粒檢測(cè)，結(jié)果表明，成功構(gòu)建了含CCD7和CCD8基因片段的RNA沉默載體p35-7+8（FR）。
　　3、通過電擊轉(zhuǎn)化法，將植物表達(dá)載體p35-7+8（FR）導(dǎo)入到農(nóng)桿菌LBA4404中，由PCR檢測(cè)表明p35-7+8（FR）/LBA4404轉(zhuǎn)化成功。利用重組的農(nóng)桿菌系統(tǒng)為介導(dǎo)，采用葉盤法將植物表達(dá)載體p35-

6、7+8（FR）導(dǎo)入番茄，建立番茄遺傳轉(zhuǎn)化再生體系。通過PCR和Southern blot對(duì)通過遺傳轉(zhuǎn)化得到78株轉(zhuǎn)p35-7+8（FR）基因再生植株基因組 DNA進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明：有32株再生植株擴(kuò)增出大小為400p的目標(biāo)條帶，與陽性對(duì)照擴(kuò)增出的條帶位置相同，初步說明目的基因已整合到番茄基因組 DNA中。隨機(jī)選取3株P(guān)CR反應(yīng)呈陽性的轉(zhuǎn)基因番茄和非轉(zhuǎn)基因番茄植株，分別用它們的PCR產(chǎn)物進(jìn)行Southern blot雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各

7、有2株轉(zhuǎn)基因植株針對(duì)這兩個(gè)基因都出現(xiàn)了雜交信號(hào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明兩個(gè)基因都已經(jīng)整合進(jìn)番茄的基因組。
　　4、本研究通過大量實(shí)驗(yàn)篩選得出：最佳種子滅菌處理方式為：75%酒精30s+0.1%升汞1min+無菌水沖洗3次；最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+6-BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L+Cef300 mg/L+Kan50mg/L。無菌苗培養(yǎng)基為：1/2MS；預(yù)、共培養(yǎng)基為：MS+6-BA0.2mg/L和MS+6-BA0.2mg/L

8、+Cef300 mg/L+Kan50mg/L；生根培養(yǎng)基為：MS+IAA0.2mg/L。
　　5、通過水培，用活性碳的方法收集了野生型番茄和轉(zhuǎn)基因番茄根系分泌物，利用乙酸乙酯對(duì)其進(jìn)行萃取，得到根系分泌物的粗提物。將根系分泌粗提物配制成1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6mg/mL的溶液，對(duì)預(yù)培養(yǎng)好的列當(dāng)種子進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)。結(jié)果顯示，列當(dāng)種子萌發(fā)率隨著根系分泌物溶液濃度的增加先升高在降

9、低，野生型、rnai-7和rnai-8都在1×10-1mg/mL時(shí)達(dá)到最大值，萌發(fā)率為分別是58.89%、27.64%和24.44%，轉(zhuǎn)基因番茄根系分泌物對(duì)列當(dāng)種子的萌發(fā)率顯著低于野生番茄對(duì)列當(dāng)種子的刺激作用。以萃取純化的番茄根系分泌物為材料，利用HPLC-MS，對(duì)5-deoxystrigol進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，標(biāo)樣在保留時(shí)間2.98min左右時(shí)出現(xiàn)了一個(gè)單一清晰的峰，但待檢測(cè)的番茄根系分泌物樣品在相近的保留時(shí)間內(nèi)沒有出峰，檢測(cè)不到5-