蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接機(jī)理研究及應(yīng)用.pdf

1、蛋白質(zhì)內(nèi)含子(intein)是存在于前體蛋白質(zhì)中的一段插入序列，其兩側(cè)的氨基酸序列稱為蛋白質(zhì)外顯子(extein)。在蛋白質(zhì)翻譯后加工成熟過程中，蛋白質(zhì)內(nèi)含子從前體蛋白質(zhì)中自我剪切，并將兩側(cè)的蛋白質(zhì)外顯子以天然肽鍵連接形成成熟的有功能的蛋白質(zhì)，這一過程被稱為蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)剪接(intein-mediatedprotein splicing)。蛋白質(zhì)內(nèi)含子根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征可分為三類，即標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)內(nèi)含子(canonical inte

2、in)，微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子(mini-intein)和斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子(split-intein)。蛋白質(zhì)內(nèi)含子的一級結(jié)構(gòu)序列中有四個位點(diǎn)的氨基酸殘基比較保守，分別為：蛋白質(zhì)內(nèi)含子N端第一個氨基酸殘基一般是Cys或Ser，到目前為止還沒有在天然的intein中發(fā)現(xiàn)Thr；模體B中有一個非常保守的Thr-X-X-His序列，X代表任何氨基酸殘基；模體G中蛋白質(zhì)內(nèi)含子末位氨基酸殘基一般是Asn，倒數(shù)第二位氨基酸殘基也非常保守，一般是His；下

3、游蛋白質(zhì)外顯子N端的第一個氨基酸殘基一般是Cys，Ser或Thr。但是，這些模體中的保守氨基酸殘基并不是絕對的，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)越來越多的例外。蛋白質(zhì)內(nèi)含子和下游蛋白質(zhì)外顯子的第一個氨基酸殘基包含了剪接所需要的全部信息，不需要外界輔酶或輔因子的參與。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)剪接包括四步親核反應(yīng)：1)蛋白質(zhì)內(nèi)含子N端第一個氨基酸殘基的側(cè)鏈親核基團(tuán)-OH/-SH對上游extein和intein之間的肽鍵發(fā)動親核攻擊，發(fā)生N-O/N-S酰基化重排

4、，上游extein轉(zhuǎn)移到N端第一個氨基酸殘基的側(cè)鏈上，形成(硫)酯鍵Ⅰ；2)下游extein N端第一個氨基酸殘基的側(cè)鏈親核基團(tuán)-OH/-SH對(硫)酯鍵Ⅰ進(jìn)行親核攻擊，上游extein轉(zhuǎn)移到下游extein N端第一個氨基酸殘基的側(cè)鏈上，形成(硫)酯鍵Ⅱ并形成分支中間產(chǎn)物；3)intein的最后一個氨基酸殘基(一般為Asn)環(huán)化生成琥珀酰亞胺環(huán)，釋放intein；4)(硫)酯鍵Ⅱ發(fā)生O-N/S-N酰基重排，形成天然肽鍵，連接上游ext

5、ein和下游extein，此步自發(fā)進(jìn)行。
　　 在應(yīng)用intein剪接外源蛋白時最重要的一點(diǎn)是在宿主蛋白中選擇一個合適的插入位點(diǎn)，因?yàn)?1位的氨基酸殘基直接參與蛋白質(zhì)剪接反應(yīng)，位點(diǎn)選擇不合適可能會導(dǎo)致intein的剪接活性被抑制。Intein的剪接反應(yīng)在催化活性中心完成，由保守位點(diǎn)的氨基酸殘基通過氫鍵和疏水作用力相互作用形成。位于活性中心的intein的第一個氨基酸殘基(1位)和下游extein的第一個氨基酸殘基(+1位)通常為

6、親核氨基酸，Cys，Ser或Thr，但是對于一個intein來說我們還不清楚這三個氨基酸殘基是否能夠互相替換，1位和+1位是不是存在著特定的組合，或者自然界中的intein對這兩個位點(diǎn)的組合是不是有一個偏愛性？為了回答這些問題在第三章中我們首次分析了NEB網(wǎng)站上已經(jīng)報道的500多個intein的1位和+1位氨基酸殘基的分布及組合特性，同時我們選取了6個已知具有剪接活性的mini-intein，通過定點(diǎn)突變將每一個intein的1位和+1

7、位的原始氨基酸殘基分別突變?yōu)榱硗鈨煞N親核氨基酸，每一個intein得到9種不同組合并檢測其剪接活性。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的intein中l(wèi)位大部分為Cys，少量為Ser還沒有發(fā)現(xiàn)Thr的存在；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示將6個mini-intein的1位的Cys突變?yōu)镾er或Thr之后，除一個intein剪接活性降低之外其余的所有突變體剪接活性都被抑制。自然界存在的intein中Cys和Ser在+1都廣泛存在，Thr占少數(shù)，將6個mini-int

8、ein+1位的Cys和Ser互換之后發(fā)現(xiàn)對intein的剪接活性基本上沒有影響。當(dāng)這兩個位點(diǎn)的氨基酸殘基作為一個組合1/+1組合進(jìn)行研究時，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示在自然界中Cys/Ser組合的intein數(shù)量最多，而沒有發(fā)現(xiàn)Ser/Cys組合，同樣我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)6個mini-intein的Cys/Ser組合都有剪接活性，而Ser/Cys都沒有剪接活性。這些發(fā)現(xiàn)對于蛋白質(zhì)剪接機(jī)制以及在目標(biāo)蛋白中選擇合適的插入位點(diǎn)提供了有意義的數(shù)據(jù)，同時我們還

9、得到了兩個剪接活性較高且+1位為Thr的mini-intein。
　　 Intein的四步剪接反應(yīng)是可以獨(dú)立進(jìn)行的，例如將1位的氨基酸殘基突變?yōu)锳la，那么第一步剪接反應(yīng)則不能發(fā)生，但是第三步Asn環(huán)化可以繼續(xù)進(jìn)行，因此導(dǎo)致C端斷裂反應(yīng)，釋放C端extein；如果將intein的最后一個氨基酸殘基Asn突變?yōu)锳la，第三步和第四步反應(yīng)就被阻止，只能發(fā)生前兩步反應(yīng)，生成的酯鍵被水解導(dǎo)致N端斷裂反應(yīng)，釋放N端extein。Intei

10、n的斷裂反應(yīng)在蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用，用來進(jìn)行蛋白純化，連接和環(huán)化等，例如NEB公司商業(yè)化的的IMPACTM蛋白純化載體就是利用intein的N端和C端斷裂反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了蛋白的一步純化。但是，這些方法利用的都是完整的mini-intein，intein和目的蛋白在宿主體內(nèi)融合表達(dá)之后往往會發(fā)生一些自發(fā)斷裂反應(yīng)，甚至有的可以達(dá)到80％，因此大大降低了目的蛋白的產(chǎn)量，增加了成本。在第四章中我們報道了一種新的方法，利用斷裂蛋白內(nèi)含子的片段

11、互補(bǔ)實(shí)現(xiàn)對intein斷裂反應(yīng)的可控，從而避免體內(nèi)自發(fā)斷裂。我們利用S11型斷裂蛋白內(nèi)含子實(shí)現(xiàn)對intein N端斷裂的控制，用S1型斷裂蛋白內(nèi)含子實(shí)現(xiàn)對intein C端斷裂的控制。在N端斷裂反應(yīng)的設(shè)計(jì)中，四個S11型斷裂蛋白內(nèi)含子Ssp DnaX，Ter ThyX，Ssp GyrB和Rma DnaB的N端序列(S11-IN)與大腸桿菌麥芽糖蛋白(MBP)融合形成前體蛋白，在大腸桿菌中表達(dá)純化，體外加入化學(xué)合成的Ssp GyrB S1

12、1split-intein的C端序列(Ic：GVFVHN)和DTT。結(jié)果表明，除了Ter ThyX之外都可以發(fā)生N-cleavage，而體內(nèi)表達(dá)和純化過程中，除了Rma DnaB有少量的自發(fā)斷裂外其余的三個intein都沒有自發(fā)斷裂發(fā)生，而且在只有DTT存在時也可以引發(fā)斷裂反應(yīng)。在C端斷裂的設(shè)計(jì)中，四個S1型斷裂蛋白內(nèi)含子Ssp DnaX，Ter ThyX，Ssp GryB和Rma DnaB的C端序列(S1-IC)與大腸桿菌硫氧還蛋白(

13、Trx)融合表達(dá)，純化后在體外加入化學(xué)合成的Ssp DnaB S1split-intein的N端序列(IN：CISGDSLISLA)。結(jié)果表明，除了SspDnaX在體內(nèi)有自發(fā)斷裂外，其余三個intein都沒有自發(fā)斷裂發(fā)生，體外加入IN和DTT可以誘發(fā)斷裂反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)利用小肽和intein大片段的互補(bǔ)形成完整的intein結(jié)構(gòu)，從而恢復(fù)intein的活性來控制其N端或C端斷裂反應(yīng)，同時我們利用一個intein的小肽來控制多個intein的

14、斷裂反應(yīng)。因此，本實(shí)驗(yàn)不僅提供了一個經(jīng)濟(jì)有效的方法避免intein的自發(fā)斷裂，還對intein的結(jié)構(gòu)有了進(jìn)一步的了解。
　　 Liu等對Ssp DnaB S1 split-intein的研究以及我們對Ter ThyX，Ssp GyrB和Rma DnaB三個S1 split-intein的研究發(fā)現(xiàn)，缺失11aa的S1-IN片段之后剩余的S1-Ic片段沒有任何的cleavage和splicing活性，只有在體外加入S1-IN片段才可

15、以誘發(fā)S1-Ic片段發(fā)生C-cleavage，而對于Ssp DnaX intein結(jié)果卻相反。在缺失11aa的S1-IN片段之后剩余的137-aa的S1-Ic片段仍然表現(xiàn)出自發(fā)的C-cleavage活性。在進(jìn)一步縮短S1-Ic片段的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Ssp DnaXmini-intein在缺失N端15個氨基酸殘基即整個Motif A之后仍然有C-cleavage活性。同時我們突變了137-aa的S1-Ic片段block B中的兩個保守氨基酸殘

16、基His和Thr，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將Thr突變?yōu)锳la之后其C-cleavage活性被大大抑制。這些結(jié)果表明了一個具有強(qiáng)生命力intein的發(fā)現(xiàn)，同時表明Block B中的Thr在intein的第三步剪接反應(yīng)中可能發(fā)揮了很大的作用，這一部分結(jié)果在第五章中有詳細(xì)討論。
　　 利用斷裂蛋白內(nèi)含子的反式剪接可以將進(jìn)行多肽片段連接，蛋白環(huán)化，NMR片段標(biāo)記，基因治療以及蛋白標(biāo)記，蛋白修飾等。在第六章中我們利用蛋白質(zhì)內(nèi)含子反式剪接開劈了一條新途徑

17、，將三個具有高剪接活性的S0型斷裂蛋白內(nèi)含子Rma DnaB，Ssp GyrB和Ter DnaE-3的N端和C端剪接區(qū)域分別與蜘蛛絲基因的編碼序列融合表達(dá)，以大腸桿菌為表達(dá)宿主，融合蛋白表達(dá)純化后通過體外剪接得到分子量為256kDa的重組蜘蛛絲蛋白，克服了大腸桿菌不能表達(dá)高分子量蛋白的缺點(diǎn)。我們還利用定向進(jìn)化得到的具有高剪接活性的Ssp GryB intein來剪接蓖麻毒素蛋白的A鏈(RicinA)。將RicinA斷裂成兩個沒有功能的片

18、段，在斷裂位點(diǎn)處分別插入SspGyrB intein的野生型和四個突變型，篩選出具有高剪接活性的mini-intein，然后將其斷裂為S11 split-intein，并在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)純化和進(jìn)行體外剪接，得到剪接產(chǎn)物，目前剪接效率只有約50%。因此，下一步的目標(biāo)是提高剪接效率，并將融合基因分別克隆到病毒載體上，通過病毒顆粒包裝，具有特異性導(dǎo)向性的病毒顆粒將攜帶這兩段融合基因通過特異性抗原抗體識別進(jìn)入癌細(xì)胞，在癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)融合蛋白，通過