蛋白質內含子介導的純化系統(tǒng)的優(yōu)化及其在生物傳感器中的應用.pdf

1、蛋白質內含子是存在于前體蛋白中的一段內含肽，它通過蛋白質剪接反應將兩端外顯子通過天然肽鍵相連接。通過突變蛋白質內含子剪接過程中的保守氨基酸，剪接型的蛋白質內含子可轉變?yōu)閿嗔研偷鞍踪|原件。例如，將N端首位保守的Cys變成Ala后，蛋白質內含子就變成C端斷裂元件?；诘鞍踪|內含子的剪接反應和突變后的斷裂反應，蛋白質內含子在蛋白質工程中有著廣泛的應用，例如在蛋白質純化、分子開關、生物傳感器、蛋白質標記等領域。本論文主要圍繞蛋白質內含子在蛋白質

2、純化和生物傳感器兩個方面的應用展開相關研究。
　　將斷裂型的蛋白質內含子與蛋白純化標簽相融合，則可產生自我斷裂蛋白質純化標簽。利用斷裂型蛋白質內含子的自我斷裂標簽，迄今已有超過百余種蛋白成功得到純化，使用的融合標簽包括:常規(guī)的層析標簽和新型的非層析標簽。但基于蛋白質內含子的自我斷裂標簽在應用過程中還存在著諸多問題:蛋白質內含子的體內提前斷裂和蛋白質內含子對目的蛋白的選擇性就是這些問題中的比較突出的兩個?；诓煌哪康牡鞍缀捅磉_環(huán)境

3、，蛋白質內含子在細菌表達時的斷裂效率一般在10-80％，而在高等哺乳動物細胞中基本沒有完整的前體蛋白。另外，與蛋白質內含子剪接反應一樣，蛋白質內含子的斷裂反應對目的蛋白也有偏好性。例如MtuRecAΔI-CM對GFP蛋白就表現出比其它蛋白更低的斷裂活性，在室溫下25h后的斷裂效率僅60％（與ELP標簽融合）。這些瓶頸將會極大限制蛋白質內含子在蛋白質工程領域中的應用。
　　為解決蛋白質內含子在體內發(fā)生提前斷裂的難題，本論文采用了兩種

4、方法:斷裂蛋白質內含子和Zn2+敏感型的蛋白質內含子。斷裂蛋白質內含子由于其結構上的不完整性，導致功能喪失。但通過添加互補片段，斷裂蛋白質內含子的結構和功能又可得到恢復。我們將ΔI-CM蛋白質內含子的剪接結構域分成兩段，分別與一個非層析標簽ELP相融合。不含蛋白質內含子N端的C端融合蛋白，由于結構上的不完整型，因此不具備C端斷裂活性。在體外通過添加其互補的N端融合蛋白，蛋白質內含子的C端的前體蛋白則可恢復斷裂活性。利用這一系統(tǒng)我們純化了

5、多個蛋白，且蛋白產量與全長蛋白質內含子系統(tǒng)相當或更高。同時，我們實驗過程還發(fā)現通過一步法，即表達后的細胞在裂解之前混合并共同純化，最終獲得的蛋白產率明顯高于標準的分步純化法。第二種斷裂型的蛋白質內含子是源于新型的S1型的SspDnaB蛋白質內含子。將缺少首11位氨基酸的SspDnaB蛋白質內含子引入到ELP-蛋白質內含子的非層析標簽系統(tǒng)中。由于結構上的缺失，缺少前11位氨基酸的SspDnaB蛋白質內含子在體內不具有剪接活性。在體外通過添

6、加化學合成的互補首11位氨基酸小肽，蛋白質內含子可恢復斷裂活性。通過這種新型的斷裂型蛋白質內含子系統(tǒng)，我們成功的制備了多種模式蛋白并對它們的活性進行了測試。
　　在蛋白質內含子的晶體解析過程中，在靠近C端剪接區(qū)域發(fā)現一個Zn2+的結合區(qū)域。之后實驗表明蛋白質內含子的剪接反應和N端斷裂反應都可被Zn2+抑制，且Zn2+的抑制作用又可通過添加金屬螯合劑消除，即可逆的。然而蛋白質內含子的C端斷裂反應與剪接或N端斷裂反應不完全相互依賴，Z

7、n2+對蛋白質內含子C端斷裂的抑制作用不如前兩者明顯。體外實驗表明，這是由于參與蛋白質內含子的C端斷裂的保守氨基酸與Zn2+的結合能力不夠強的原因造成的。這里我們通過結構生物學的方法設計了多個金屬離子Zn敏感型的C端斷裂蛋白質內含子，并定性、定量分析了它們對Zn2+的敏感程度。實驗通過在MtuRecAΔI-CM蛋白質內含子的N端引入突變并與蛋白質內含子中參與C端斷裂反應的His439共同組成Zn2+結合區(qū)域，然后在體外測試Zn2+對C端

8、斷裂反應的抑制作用。這里共設計了6種不同的Zn2+敏感C端斷裂型蛋白質內含子突變體（分別命名為001，002，003，003b，004和004b），然后將這些突變體引入到常見的蛋白質內含子活性評價模式蛋白MI-aFGF系統(tǒng)中，并對它們的Zn2+敏感性進行了篩選。研究發(fā)現在6個突變體中，突變體002由于體內斷裂效率過高，以致體外無法獲得未斷裂前體，而另一突變體(001)在體內外均不具備斷裂活性。在單劑量(1mM)實驗中，Zn2+對剩于4個

9、突變體以及野生型ΔI-CM的C端斷裂抑制效率均可達80％左右，且這一抑制效應是可逆的。經半最大效應濃度(EC50)測試，發(fā)現003與野生型ΔI-CM對Zn離子敏感程度相當，004對Zn離子的敏感程度比野生型提高了1倍，而03b與04b對Zn離子的敏感程度5倍高于其野生型。除此之外，我Zn2+敏感型03b和04b突變體斷裂速率也明顯快于野生型。
　　蛋白質內含子對目的蛋白的偏好性致使其對某些目的蛋白的斷裂效率較低，而這也極大地限制了

10、其在蛋白質純化領域中的應用。我們通過對MtuRecAΔI-CM蛋白質內含子首位氨基酸進行20種氨基酸的突變，篩選得到一例以Gly為首位氨基酸的突變型(IG)蛋白質內含子。與野生型相比IG突變體更具通用性，且對溫度也更加敏感。當與MBP標簽相融合，在37℃下5小時內IG突變體基本可完成先前系統(tǒng)中斷裂效率較慢的GFP斷裂反應，而在同等條件下野生型的最終斷裂斷裂效率只有70％;在室溫或更低溫度條件下IG突變體與野生型斷裂效率卻相當。當與ELP

11、標簽相融合，這一差異更加明顯。此外，我們還發(fā)現IG突變體在C端斷裂過程會產生一個由其末位Asn與-1位Lys或-3位Lys形成的酰胺鍵。將目的蛋白質插入至蛋白質內含子內部，利用這一特殊的側鏈反應我們還制備了蛋白質內含子與目的蛋白的融合環(huán)肽。通過這種方法制備的融合環(huán)肽同樣具備其它環(huán)肽所具有的熱穩(wěn)定。經過100℃孵育半小時后，蛋白上清中仍有10％的融合環(huán)化蛋白。
　　蛋白質內含子除了在蛋白質純化中有著廣泛的應用，蛋白質內含子對融合蛋白

12、的結構還有穩(wěn)定性的作用?；诖?，我們前期構建了一系列的基于蛋白質內含子的核荷爾蒙激素微生物傳感器，包括雌性激素（estrogen），甲狀腺激素(thyroid)等。這種荷爾蒙微生物傳感器是基于細菌生長表型，即只有當配體與其受體結合時，細菌才可產生生長表型信號，且生長信號的強弱與配體和配體結合域的結合能力呈正相關關系，反之細胞則不能生長。與其它常規(guī)核荷爾蒙檢測系統(tǒng)相比，這種基于細菌生長表型的生物傳感器有著許多優(yōu)勢，包括:使用成本低、高通量

13、以及易于操作等。在這里我們利用之前構建的甲狀腺激素微生物傳感器，研究了6個臨床發(fā)現的在甲狀腺激素配體結合區(qū)域中引起耐甲狀腺激素癥(Resistancetothyroidhormone)的突變對甲狀腺激素與受體結合的影響。研究表明，甲狀腺激素微生物傳感器不僅可以識別檢測甲狀腺激素化合物，同時還可以識別激素受體中的突變。這些突變在甲狀腺激素與其受體結合過程中的作用是不等同的:有些突變會讓配體結合域完全喪失配體結合能力，而另外一些則會讓配體結

14、合域部分喪失配體結合能力。通過測試它們的半最大效應濃度測試(EC50)，我們定量分析了這些突變體對多個配體（包括天然與人工合成）與受體結合過程中影響狀況，所得到的突變體對配體結合過程中的相對影響與許多其它系統(tǒng)中的得到的數據相一致。此外，我們還發(fā)現在這些突變體中的一個會使得配體結合域對拮抗劑更加敏感。
　　綜上所述，本研究論文優(yōu)化了現有的基于蛋白質內含子的自我斷裂標簽系統(tǒng)，且利用含有蛋白質內含子的細菌傳感器研究了人甲狀腺激素受體中的