新型斷裂蛋白質內含子體外剪接動力學的研究.pdf

1、蛋白質內含子（intein）是鑲嵌在宿主蛋白質中的插入序列，在宿主蛋白質成熟過程中能夠自我剪切下來，同時將兩側的序列-蛋白質外顯子（exteins）通過肽鍵相連接，形成成熟的蛋白質。蛋白質的這一成熟過程被稱為蛋白質順式剪接（proteincis-splicing）。斷裂蛋白質內含子（split-intein）是在蛋白質內含子內部區(qū)域特定位點發(fā)生斷裂，形成N-端蛋白(IN)和C-端蛋白(IC)，分別由基因組上相距較遠的兩個開放閱讀框（op

2、enreadingframe，ORF）編碼。在翻譯后成熟過程中，IN和IC相互識別，重建催化活性中心，介導蛋白質反式剪接(proteintrans-splicing)。
　　 通過人工改造斷裂蛋白質內含子的斷裂位點，使之靠近蛋白質內含子的N-末端或C-末端，即形成了新型斷裂蛋白質內含子。斷裂蛋白質內含子介導的蛋白質反式剪接技術在蛋白質純化、基因治療、環(huán)狀多肽制備以及大分子復雜蛋白質的生產(chǎn)方面已取得了一些成果。新型斷裂蛋白質內含子

3、在此基礎上擴大了斷裂蛋白質內含子的應用，提供了在目的蛋白質的N-末端或C-末端標記任意化學基團的潛力。在進行應用之前需要對這一反應的酶促動力學進行全面的了解，因而，新型斷裂蛋白質內含子剪接動力學的研究顯得十分重要。
　　 本課題選取新型斷裂蛋白質內含子SX-S1、TX-S1、SX-S11和TE3-S11進行剪接動力學的研究。本研究中S1型斷裂蛋白質內含子的N端僅含有11個氨基酸，S11型斷裂蛋白質內含子的C端僅含有6個氨基酸，易

4、于化學合成，可以應用于重組蛋白質或藥物的N-末端或C-末端熒光素、生物素等標記。
　　 構建只含有N端前體蛋白或C端前體蛋白相應序列的表達質粒，麥芽糖結合蛋白(maltosebindingprotein，MBP)與IN組成的融合蛋白為N端前體蛋白;Ic與硫氧還蛋白(thioredoxin，T)組成的融合蛋白為C端前體蛋白。利用N端前體蛋白帶有的MBP標簽可以與Amyloseresin特異性結合，C端前體蛋白帶有的6×組氨酸標簽可

5、以與Ni-NTAresin特異性結合，純化得到用于后續(xù)體外反應所需的N端前體蛋白和C端前體蛋白。
　　 將純化的N端前體蛋白與C端前體蛋白在摩爾比為1∶1的條件下進行反應，通過Western印跡檢測剪接反應的活性，結果表明，斷裂蛋白質內含子SX-S1、TX-S1、SX-S11和TE3-S11在體外均有剪接活性。將N端前體蛋白和C端前體蛋白兩兩組合進行體外交叉反應，除TX-S1N/SX-S1C組合外，其它組合均無交叉反應，為同時使

6、用多個斷裂蛋白質內含子對一個目的蛋白進行多段標記或對多個目的蛋白進行標記奠定基礎。在不同的DTT的濃度、溫度、氯化鈉的濃度和pH值條件下，探索斷裂蛋白質內含子剪接的最優(yōu)化條件，結果表明，除反應體系中無DTT存在時，剪接效率明顯下降甚至無剪接反應發(fā)生以外，其余條件對剪接反應影響較小。
　　 當N端前體蛋白與C端前體蛋白摩爾比為10∶1混合時，動力學分析實驗結果表明，斷裂蛋白質內含子SX-S1、TX-S1、SX-S11和TE3-S1

7、1體外剪接效率分別達到～96％、～50％、～93％和～87％，剪接速率常數(shù)分別為(2.68±0.39)×10-4s-1、(2.19±0.33)×10-3s-1、(3.94±0.91)×10-4s-1和(3.43±0.59)×10-4s-1。
　　 新型斷裂蛋白質內含子在位點特異性蛋白標記的潛在應用，使蛋白質標記不再局限于傳統(tǒng)的氨基酸特異性標記。新型斷裂蛋白質內含子將在蛋白質工程、蛋白質藥物開發(fā)和蛋白質結構與功能研究等方面有非常廣