構(gòu)建及篩選S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子用于蛋白質(zhì)定點標(biāo)記.pdf

1、蛋白質(zhì)內(nèi)含子是位于宿主蛋白質(zhì)中的插入序列，在蛋白成熟過程中自我去除，并以肽鍵連接兩側(cè)的宿主蛋白質(zhì)序列(稱為蛋白外顯子)，蛋白質(zhì)這一成熟過程被稱為蛋白質(zhì)剪接。斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子是指蛋白質(zhì)內(nèi)含子被分裂成兩部分即N端區(qū)域(IN)和C端區(qū)域(IC)，分別由不同的開放閱讀框表達。斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的獨特性是能夠分段表達或合成，并且能夠特異性識別，為蛋白質(zhì)合成和修飾提供了新的途徑，因而在蛋白質(zhì)工程及其它領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　 在蛋白質(zhì)標(biāo)

2、記領(lǐng)域，應(yīng)用新型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子對目的蛋白特異位點進行修飾或標(biāo)記，有助于更深入地研究目的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。目前在蛋白質(zhì)標(biāo)記領(lǐng)域中所采用的是人工構(gòu)建的斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子，該方法用于定點標(biāo)記的局限性在于：(1)異源宿主中蛋白質(zhì)剪接效率可能大大降低甚至不能發(fā)生剪接反應(yīng)，并且其剪接需要的蛋白質(zhì)外顯子的氨基酸也是特定的，限制了蛋白質(zhì)內(nèi)含子的應(yīng)用范圍；(2)大片段的斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子與目的蛋白進行融合表達，這樣可能造成目的蛋白可溶性的改變或其它不可知的

3、影響；(3)人工合成小肽增加了實驗成本等。
　　 為克服上述局限性，本課題構(gòu)建6個新型的S1型斷裂蛋白內(nèi)含子，將其C端半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸，并且將兩側(cè)的天然外顯子替換為一段通用性高的連接小肽(GG-SAG)，對新型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子體內(nèi)和體外的剪接活性進行檢測，篩選出合適的斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子進行應(yīng)用。
　　 本文利用實驗室已有的微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子進行改造，成功構(gòu)建了6個C端無半胱氨酸的S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子(稱為CF-inte

4、in)，通過對體內(nèi)剪接活性的分析，篩選出3個具有相對較高剪接活性的斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子(CFRBS1，CFTXS1和CFSXS1)進行體外剪接活性檢測。結(jié)果分析表明：CFRBS1 intein具有較穩(wěn)定的剪接活性，較高的剪接活性以及較快的剪接速率；同時模式蛋白的標(biāo)記檢測結(jié)果也顯示，CFRBS1 intein可進行蛋白質(zhì)定點標(biāo)記應(yīng)用。
　　 本課題中期望改造后的S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子在進行應(yīng)用時，特異性較高，不僅可以帶上熒光基團、標(biāo)簽