中心蛋白C端半分子及其磷酸化性質(zhì)的研究.pdf

1、中心蛋白(centrin)是一種分子量大約為20 kDa的中心體常駐蛋白，它與細(xì)胞內(nèi)纖維收縮、細(xì)胞分裂及紡錘體的分離等密切相關(guān)。在細(xì)胞內(nèi)，蛋白質(zhì)可逆磷酸化是一種重要的共價(jià)翻譯后修飾(PTMs)，為生物體內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞調(diào)節(jié)起到重要作用。因此其在機(jī)體內(nèi)的磷酸化與去磷酸化行為，為細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)提供了一個(gè)重要的調(diào)控機(jī)制。
　　 每個(gè)中心蛋白分子均含有四個(gè)結(jié)構(gòu)域，每一個(gè)結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合一個(gè)金屬離子，其中Ⅰ、Ⅱ結(jié)合位點(diǎn)位于蛋白的N端結(jié)構(gòu)

2、域;Ⅲ、Ⅳ結(jié)合位點(diǎn)位于蛋白的C-端結(jié)構(gòu)域。本文選用中心蛋白C-端半分子(C-EoCen)為研究對(duì)象，著重研究了由蛋白激酶A介導(dǎo)的C-EoCen磷酸化前后同金屬離子之間的相互作用以及化學(xué)交聯(lián)的性質(zhì)。
　　 首先運(yùn)用分子生物學(xué)方法，構(gòu)建得到了一個(gè)基因重組質(zhì)粒pGEX-6p-C-EoCen，將重組質(zhì)粒pGEX-6p-C-EoCen轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，獲得表達(dá)工程菌并挑取單菌落活化、培養(yǎng)誘導(dǎo)，離心收集菌體，超聲裂解液經(jīng)GS

3、T柱親和層析、PPase酶切、濃縮處理后獲得中心蛋白C-端半分子(C-EoCen)。經(jīng)SDS-PAGE分析顯示所得蛋白不含有雜蛋白條帶，達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需純度。
　　 運(yùn)用熒光光譜、圓二色光譜和紫外差光譜的方法研究C-EoCen與Sm3+的結(jié)合。發(fā)現(xiàn)Sm3+與C-EoCen結(jié)合后，蛋白質(zhì)從關(guān)閉式構(gòu)象轉(zhuǎn)換為開(kāi)放式構(gòu)象，蛋白的疏水性結(jié)構(gòu)域外露程度增強(qiáng);蛋白質(zhì)的α-螺旋含量明顯增強(qiáng);Sm3+與C-EoCen的Ⅲ、Ⅳ結(jié)合位點(diǎn)的條件穩(wěn)定常數(shù)分別

4、為:lgKⅣ=6.81±0.51，lgKⅢ=6.23±0.39。
　　 Native-PAGE、TNS熒光實(shí)驗(yàn)表明PKA可以催化C-EoCen發(fā)生磷酸化反應(yīng);磷酸化修飾后的C-EoCen暴露的疏水面積比磷酸化前的蛋白減少，并發(fā)現(xiàn)金屬離子Ca2+、Tb3+、Gd3+對(duì)C-EoCen的磷酸化均有抑制作用，隨著金屬離子的增加抑制作用更為明顯。
　　 利用Native-PAGE、TNS熒光實(shí)驗(yàn)表明，磷酸化前后的中心蛋白C-端半分