游仆蟲酸性核糖體磷酸化蛋白的性質(zhì)研究.pdf

1、真核生物核糖體60S大亞基上存在著一類保守的酸性核糖體磷酸化蛋白(P蛋白),包括P0,P1和P2,它們?cè)诤颂求w上共同形成一個(gè)獨(dú)特的向外側(cè)凸出的五聚體復(fù)合物莖區(qū),此莖區(qū)與28SrRNA的一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域共同形成一個(gè)GTPase相關(guān)位點(diǎn),并在蛋白質(zhì)翻譯延伸過程起著重要的作用。P蛋白的C-末端結(jié)構(gòu)域幾乎從低等生物到高等真核生物均高度保守,其保守的氨基酸序列為SDD/EDMGFGLFD。真核生物P蛋白具有一些特殊的性質(zhì)。首先,P蛋白可以被CK2或

2、者生物體內(nèi)其它一些蛋白激酶磷酸化;其次,在生物體內(nèi)磷酸化狀態(tài)的P蛋白具有生物活性,未磷酸化的P蛋白則失去結(jié)合大亞基的功能,并從核糖體上分離出來。第三,磷酸化的P蛋白更易于結(jié)合延伸因子2(EF-2)參與蛋白質(zhì)合成的延伸過程。蛋白激酶CK2,是一種高度保守的真核細(xì)胞中普遍存在的信使非依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,它是由兩個(gè)催化亞基(α和α’)和兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基(β)構(gòu)成的不均一四聚體。CK2的磷酸化底物具有多樣性,這些底物包括許多關(guān)鍵酶、生長因

3、子、轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞骨架蛋白等。
　　纖毛蟲是一類單細(xì)胞原生動(dòng)物,含有一個(gè)大核以及一個(gè)小核。大核為營養(yǎng)核,小核為生殖核,小核在有性生殖過程中發(fā)育為大核,通過基因的刪除、斷裂、擴(kuò)增形成大核染色體,每個(gè)染色體為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位,由端粒(C4A4C4A4C4)、編碼區(qū)以及兩側(cè)的非編碼區(qū)組成。纖毛蟲中存在密碼子使用的特殊性,比如游仆蟲,將UAA和UAG作為終止密碼子,UGA編碼半胱氨酸。目前研究還發(fā)現(xiàn)游仆蟲中超過5％的基因發(fā)生了編程性翻譯移碼(

4、Programmed translational frameshift),且均為+1位的移碼突變。
　　本研究以八肋游仆蟲(一種淡水纖毛蟲)為材料,采用PCR的方法,從基因組和cDNA中克隆了酸性核糖體磷酸化蛋白P0, P1和P2基因(命名為EoP0, EoP1和EoP2)。構(gòu)建了重組質(zhì)粒pRSETC-EoP0和pRSETC-EoP2,在大腸桿菌BL21中表達(dá)并利用鎳柱進(jìn)行了純化。利用核磁共振、Native-PAGE以及Phos-

5、tagTM SDS-PAGE三種方法檢測EoP2的磷酸化作用。利用pull-down檢測EoP2及磷酸化狀態(tài)的EoP2與EoEF-2之間的相互作用。獲得以下主要結(jié)果:
　　1.八肋游仆蟲EoP0、EoP1和EoP2基因的克隆。分別以八肋游仆蟲基因組和cDNA為模板,PCR擴(kuò)增得到EoP0和EoP2的全長以及開放閱讀框基因,EoP0和EoP2的開放閱讀框分別為1002 bp和336 bp;利用生物信息學(xué)軟件分析以及PCR擴(kuò)增得到Eo

6、P1的開放閱讀框?yàn)?54 bp。序列比對(duì)結(jié)果顯示已獲得的八肋游仆蟲P蛋白基因都不具有類似其他真核生物P蛋白高度保守的C-末端序列,EoP0和EoP2比其他真核生物的C末端多出5-7個(gè)氨基酸,而EoP1比其他真核生物少5-7個(gè)氨基酸,且末端3個(gè)氨基酸為DEY。EoP1、EoP2和EoP0的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示八肋游仆蟲本身P蛋白的C末端也并不具有高度保守性。
　　2.EoP0和EoP2蛋白的表達(dá)與純化。成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pRSET

7、C-EoP0和pRSETC-EoP2,在大腸桿菌BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),并利用鎳柱和脫鹽柱對(duì)EoP2純化,獲得較高純度的EoP2蛋白。將得到的高純度高濃度的EoP2蛋白免疫小鼠,制備了EoP2的多克隆抗體,抗體效價(jià)達(dá)到1:6000到1:12800(P/N>2.5)。
　　3.EoP2蛋白磷酸化作用的檢測。利用NetPhos2.0軟件預(yù)測EoP2蛋白磷酸化作用位點(diǎn),包括Ser19(0.991)、Ser21(0.991)、Ser29(

8、0.661)、Ser66(0.868)、Thr17(0.665)、Thr41(0.958)、Tyr112(0.960);Phos-tagTM SDS-PAGE和核磁共振結(jié)果均顯示在體外EoP2可以被CK2磷酸化。我們選擇預(yù)測磷酸化作用分值較高的位點(diǎn)Ser19(0.991)、Ser21(0.991)、Thr41(0.958)和Tyr112(0.960)進(jìn)行單點(diǎn)以及多點(diǎn)突變,并在體外表達(dá)及純化突變體蛋白。同時(shí)在體外表達(dá)并純化CK2催化亞基C

9、K2α和調(diào)節(jié)亞基CK2β。核磁共振結(jié)果顯示除EoP2-S21A和EoP2-S19A-S21A之外,WT-EoP2、EoP2-S19A、EoP2-T41A和EoP2-Y112A均可被CK2磷酸化,初步認(rèn)為EoP2的磷酸化作用位點(diǎn)位于S21位。同時(shí),我們還利用Native-PAGE檢測磷酸化作用,發(fā)現(xiàn)EoP2磷酸化后的蛋白比非磷酸化的蛋白具有更高的遷移率,進(jìn)一步證明EoP2的磷酸化作用位點(diǎn)位于N-端結(jié)構(gòu)域的S21位。
　　4.EoP2

10、和EoEF-2的相互作用位點(diǎn)分析。從八肋游仆蟲基因組和cDNA中克隆得到EoEF-2全長和開放閱讀框基因;將讀框中 TGA突變?yōu)榇竽c桿菌中編碼半胱氨酸的密碼子TGT并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)純化。對(duì)EoP2和EoEF-2分別進(jìn)行截短突變,共構(gòu)建突變體6個(gè),利用pull-down研究EoP2和EoEF-2的相互作用位點(diǎn),結(jié)果表明二者的相互作用位點(diǎn)位于EoP2的C-末端結(jié)構(gòu)域和EoEF-2的N-端結(jié)構(gòu)域。將EoP2基因中21位絲氨酸定點(diǎn)突變?yōu)?/p>

11、天冬氨酸模擬其磷酸化作用,并利用pull-down檢測磷酸化蛋白與EoEF-2之間的相互作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)磷酸化后的蛋白并未明顯加強(qiáng)兩者之間的相互作用。
　　綜上所述,八肋游仆蟲酸性核糖體磷酸化蛋白基因(EoP0, EoP1和EoP2)與NCBI中已報(bào)道的其他生物的相應(yīng)序列具有同源性,但其卻具有特殊的C-末端結(jié)構(gòu)域;通過pull-down實(shí)驗(yàn)證明EoP2和EoEF-2的相互作用位點(diǎn)位于該特殊的C-末端結(jié)構(gòu)域以及EoEF-2的N-端結(jié)構(gòu)

12、域,推測EoP2在蛋白質(zhì)合成的延伸階段可能具有重要的作用。Phos-tagTM SDS-PAGE、Native-PAGE和核磁共振結(jié)果顯示EoP2可以被CK2磷酸化,但與其他生物不同的是其磷酸化位點(diǎn)并不位于C-末端結(jié)構(gòu)域,而是位于N-端結(jié)構(gòu)域的S21位,且模擬的磷酸化蛋白并未增強(qiáng)與EoEF-2之間的相互作用,暗示磷酸化后的P2蛋白可能在蛋白延伸過程中具有其他特殊的生物學(xué)功能。八肋游仆蟲酸性核糖體蛋白的性質(zhì)研究為進(jìn)一步研究低等真核生物酸性