磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)建立及其初步應(yīng)用.pdf

1、本文論述了磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)建立及其初步應(yīng)用。 磷酸化作為生物體內(nèi)最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一，在細(xì)胞信號(hào)傳遞中占有極重要的地位。而磷酸化修飾研究中最主要的限速點(diǎn)就是低豐度磷酸化蛋白的鑒定。 本文在先前建立的表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步以高靈敏度的4700質(zhì)譜儀為依托，建立了一套磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)平臺(tái)，并將其初步應(yīng)用于PKCδ磷酸化底物的識(shí)別研究中。 首先，基于MALDI-TOF-TOF 質(zhì)

2、譜儀，以標(biāo)準(zhǔn)磷酸化肽和標(biāo)準(zhǔn)磷酸化蛋白評(píng)估各種檢測(cè)磷酸肽的方法：反射模式譜圖中通過(guò)磷酸化亞穩(wěn)態(tài)離子峰辨識(shí)磷酸肽；負(fù)離子模式和銨鹽對(duì)于磷酸肽的質(zhì)譜效應(yīng)；固相金屬親和色譜（IMAC）對(duì)磷酸肽的富集；堿性磷酸酶法證實(shí)磷酸肽；串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定磷酸化位點(diǎn)。 其次，利用商品化的磷酸化蛋白富集柱富集分離磷酸化蛋白，結(jié)合高分辨率的雙相電泳和特異結(jié)合磷酸化蛋白的熒光染料，實(shí)現(xiàn)了基于凝膠電泳的差異磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)。 最后，利用所建