小鼠與人睪丸磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、背景:
　　精子發(fā)生是一項(xiàng)涉及精原細(xì)胞有絲分裂，精母細(xì)胞減數(shù)分裂及精子變形的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程。在精子發(fā)生中，這些環(huán)節(jié)受到一系列基因的調(diào)控。其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生錯(cuò)誤，都有可能導(dǎo)致精子發(fā)生的異常，甚至?xí)?dǎo)致雄性不育，這已經(jīng)被各種來(lái)自臨床及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的數(shù)據(jù)所證實(shí)。
　　精子發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，受到轉(zhuǎn)錄水平與轉(zhuǎn)錄后水平多層次的調(diào)控。其中磷酸化修飾，一種被廣泛研究并在多種通路中發(fā)揮作用的修飾，在精子發(fā)生過(guò)程中也發(fā)揮著重要調(diào)控作用。因此，

2、在睪丸中系統(tǒng)分析磷酸化修飾對(duì)深入研究精子發(fā)生的分子調(diào)控是十分必要的。之前的研究已經(jīng)幫助我們對(duì)磷酸化修飾在精子發(fā)生中的作用有一定的認(rèn)識(shí)。而另一方面，隨著高分辨率、大規(guī)模質(zhì)譜儀器的發(fā)展和應(yīng)用，蛋白質(zhì)組學(xué)可以幫助我們?nèi)笆降牧私饩影l(fā)生。構(gòu)建睪丸磷酸化蛋白譜系，是通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)研究精子發(fā)生中磷酸化修飾的一種直接有效的方式。然而，目前為止，小鼠中僅有3周的磷酸化蛋白質(zhì)譜系的研究，人睪丸磷酸化蛋白質(zhì)位點(diǎn)的組成及調(diào)控機(jī)制亦未見(jiàn)報(bào)道。
　　研究

3、方法與結(jié)果:
　　在本研究中，我們利用高分辨率的LTQ Orbitrap Velos質(zhì)譜儀器，基于IMAC與TiO2兩種磷酸化肽段富集策略，在成年小鼠睪丸中鑒定到17829個(gè)磷酸化位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)3955個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)。對(duì)譜系數(shù)據(jù)進(jìn)行初步分析表明，富集到的磷酸化位點(diǎn)殘基的絲氨酸(pS)，蘇氨酸(pT)及酪氨酸(pY)的比例約為82％，16％及2％，共有48.31％的磷酸化位點(diǎn)在IMAC及TiO2富集中均鑒定到。通過(guò)進(jìn)一步生物信息學(xué)分析，

4、發(fā)現(xiàn)在本研究的三種（Total，IMAC及TiO2）數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均顯示為精子發(fā)生(GO:0007283)為最顯著富集。蛋白的自體磷酸化(GO:0046777)也顯示顯著富集，這些結(jié)果說(shuō)明在睪丸中，磷酸化調(diào)控是大量存在的。通過(guò)構(gòu)建睪丸中激酶及其底物磷酸化位點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析，我們預(yù)測(cè)了與精子發(fā)生相關(guān)的重要調(diào)控性激酶及其底物調(diào)控關(guān)系。盡管兩種富集方法鑒定得到的磷酸化位點(diǎn)只有大約50％的重合率，但對(duì)底物對(duì)應(yīng)的激酶活性程度分析結(jié)果顯示，pol

5、o-like激酶在兩種富集方法中都顯示出顯著高活性，因此，我們推測(cè)polo-like激酶在精子發(fā)生中有重要功能。通過(guò)western blot檢測(cè)PLK1激酶活性位點(diǎn)pT210磷酸化水平確定PLK1在睪丸中和其余組織中的不同活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果一致，PLK1在睪丸中的活性隨著睪丸的成熟增加，并且比同周齡的其他組織中PLK1具有更高活性。體外實(shí)驗(yàn)中，在精母細(xì)胞系GC2中進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示PLK1-3的活性調(diào)控細(xì)胞周期。
　　在

6、構(gòu)建了小鼠睪丸磷酸化蛋白質(zhì)譜系的基礎(chǔ)上，調(diào)整了IMAC與TiO2富集方式與一維分離策略，進(jìn)一步對(duì)成年人睪丸的磷酸化修飾蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，共鑒定到16364個(gè)磷酸化位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)4683個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)。兩種方法富集到的磷酸化位點(diǎn)殘基的絲氨酸(pS)，蘇氨酸(pT)及酪氨酸(pY)的比例約為86％，12％及2％。GO分析顯示，有絲分裂細(xì)胞周期(GO:0000278)，基因表達(dá)(GO:0010467)，RNA剪切(GO:0008380)，有絲分裂(

7、GO:0007067)，蛋白質(zhì)磷酸化(GO:0006468)及精子發(fā)生(GO:0007283)均呈現(xiàn)顯著富集。對(duì)本研究中鑒定到的磷酸化位點(diǎn)構(gòu)建激酶及其底物磷酸化位點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，大于60％的激酶對(duì)應(yīng)不僅一個(gè)底物，這說(shuō)明磷酸化激酶是復(fù)雜的多重調(diào)控。將小鼠睪丸磷酸化蛋白質(zhì)譜系與人睪丸磷酸化蛋白質(zhì)譜系進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)序列同源分析，結(jié)果顯示，以人睪丸磷酸化位點(diǎn)為背景，30.1％的位點(diǎn)為人和小鼠同源的磷酸化位點(diǎn)，39.5％的基因可表達(dá)人和小鼠磷酸