雙去甲氧基姜黃素對星形孢菌素誘導(dǎo)小鼠心肌細胞凋亡的影響及機制.pdf

1、心血管疾病是臨床上最常見、對人類健康和生命危害最大的殺手，是全球范圍的重大公共問題，如何降低其發(fā)病及致殘、致死率，是我們廣大醫(yī)務(wù)工作者的首要解決的問題。無論是高血壓、冠心病還是心肌病等疾病，其共同的病理改變是促進和導(dǎo)致心肌細胞的重構(gòu)與死亡，特別是如何挽救瀕死的心肌細胞，保護心臟的收縮功能，是搶救生命和改善生存質(zhì)量的關(guān)鍵措施。而在心肌細胞受損死亡中主要有壞死和凋亡兩種方式，心肌細胞的壞死是一種不可逆轉(zhuǎn)的病理過程，而心肌細胞的凋亡則可以通過

2、干預(yù)被逆轉(zhuǎn)，是挽救受損心肌的主要方式。因此，及時的干預(yù)并逆轉(zhuǎn)心肌細胞的凋亡結(jié)局是臨床上治療各類心臟疾病，保護心臟功能的重要手段。為此，人們在不斷積極探索和開發(fā)各類具有保護心肌細胞的藥物。
　　雙去甲氧基姜黃素（BDMC）是傳統(tǒng)中藥姜黃根莖中的提取成分，與姜黃素相比具有更好的生物利用度和穩(wěn)定性，而且也具有良好的抗氧化、抗炎功能。研究顯示BDMC能抑制血管平滑肌遷移和增殖，改善高脂飲食導(dǎo)致的小鼠肥胖，同時還能減輕細胞老化?；谠摶衔?/p>

3、有良好的藥理學(xué)效應(yīng)和穩(wěn)定的化學(xué)特性，那么，它對各類損傷性心肌細胞發(fā)生凋亡是否也有保護作用呢？機制如何？這個科學(xué)問題正是本研究的主要目的。
　　Nrf2/ARE通路目前被認為是細胞內(nèi)源性抵抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵機制。核因子 NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）是重要的內(nèi)源性抗氧化反應(yīng)核轉(zhuǎn)錄因子。在氧化應(yīng)激條件下被激活入核與抗氧化反應(yīng)原件ARE結(jié)合啟動下游抗氧化應(yīng)激相關(guān)的蛋白與酶表達，在心臟及其他器官的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)、抗炎以及抗凋亡中起到非常重

4、要的作用。然而，對于BDMC素和Nrf2的研究甚少，關(guān)于BDMC是否能在心肌中激活Nrf2對心肌起到保護作用，目前尚不清楚。所以，本研究擬應(yīng)用星形孢菌素誘導(dǎo)小鼠心肌凋亡并觀察BDMC的保護作用，進一步探討Nrf2/HO-1通路在其保護心肌中的意義。
　　研究目的：
　　1．應(yīng)用星形孢菌素誘導(dǎo)的小鼠心肌凋亡模型，觀察BDMC對心肌細胞凋亡的影響。
　　2．探討Nrf2/HO-1通路在BDMC心肌保護中的作用及其機制。

5、r>　　研究方法：
　　1.培養(yǎng)原代心肌細胞：常規(guī)取C57小鼠乳鼠（1-2天）心臟、剪碎、膠原酶消化、差速貼壁分離心肌細胞并培養(yǎng)。
　　2.使用星形孢菌素(STS)建立心肌凋亡模型：4μM STS作用原代小鼠心肌細胞8h，通過檢測心肌胞生存率、caspase-3酶活性、TUNEL染色法檢測心肌細胞凋亡，確定心肌細胞凋亡模型。
　　3.實驗分組組別有：對照組、STS組、BDMC+STS組、BDMC+STS+SnPPⅨ組、

6、BDMC+STS+LY294002組、BDMC+STS+PD98059組、BDMC組
　　4. CCK-8法檢測相應(yīng)各組心肌胞生存率
　　5.熒光定量法檢測相應(yīng)各組caspase-3酶活性
　　6. TUNEL法檢測相應(yīng)各組心肌細胞凋亡
　　7.熒光定量法檢測相應(yīng)各組心肌細胞內(nèi)ROS水平
　　8. Western-blot檢測相應(yīng)各組總的Nrf2、HO-1、p-Akt、p-ERK的表達水平及胞漿與胞核Nrf

7、2水平
　　9.免疫熒光觀察各組的Nrf2的入核轉(zhuǎn)位情況
　　10.使用PI3K/Akt通路抑制劑LY294002和MEK/ERK的通路抑制劑PD98059以及Nrf2/HO-1通路抑制劑SnPPⅨ。
　　研究結(jié)果：
　　1.與對照組相比，STS組心肌細胞生存率明顯下降（P＜0.05，n=10）；與STS組相比較， BDMC+STS組心肌細胞生存率明顯提高（P＜0.05，n=10）；與BDMC+STS組相比，BD

8、MC+STS+SnPPⅨ組及BDMC+STS+LY294002組心肌細胞存活率又明顯降低（P＜0.05，n=10），而BDMC+STS+PD98059組心肌細胞存活率無明顯變化（P＞0.05，n=10）。
　　2.與對照組比較，STS組心肌細胞caspase-3酶活性明顯增加（P＜0.05，n=10）；與STS組相比較， BDMC+STS組心肌細胞caspase-3酶活性顯著降低（P＜0.01， n=10）；與BDMC+STS組相

9、比， BDMC+STS+LY294002組心肌細胞caspase-3酶活性明顯升高（P＜0.01，n=10），而BDMC+STS+SnPPⅨ組及BDMC+STS+PD98059組心肌細胞caspase-3酶活性無明顯變化（P＞0.05，n=10）。
　　3.與對照組比較，STS組心肌細胞TUNEL陽性細胞數(shù)明顯增加（P＜0.05，n=5）；與STS組比較， BDMC+STS組能減少TUNEL陽性細胞數(shù)，明顯降低心肌細胞凋亡指數(shù)（P

10、＜0.01，n=5）；而與BDMC+STS組相比，BDMC+STS+SnPPⅨ組TUNEL陽性細胞數(shù)量增加，即不能減輕心肌細胞凋亡（P＜0.01，n=5）。
　　4.與對照組相比，STS組心肌細胞內(nèi)ROS水平明顯增加（P＜0.05，n=8）；與STS組相比較，BDMC+STS組能顯著降低心肌細胞內(nèi)ROS水平（P＜0.01，n=8）。
　　5.與STS組相比較，BDMC+STS組能HO-1、p-Akt、p-ERK的蛋白水平明顯

11、升高（P＜0.05，n=5），與對照組相比BDMC組HO-1、p-Akt、p-ERK的蛋白水平也明顯升高（P＜0.05，n=5）
　　6.與STS組和對照組相比，免疫熒光顯示BDMC+STS組以及BDMC組細胞核Nrf2明顯增加，細胞漿Nrf2有減少趨勢。Wstern-blot顯示，與STS組和對照組相比， BDMC+STS組和BDMC組細胞核Nrf2水平明顯升高（P＜0.05，n=5），漿Nrf2減少（P＜0.05，n=5）。<

12、br>　　7.加入 LY294002和 PD98059后，免疫熒光顯示與 BDMC+STS組相比， BDMC+STS+LY294002組核 Nrf2水平減少，胞漿 Nrf2水平升高，而BDMC+STS+PD98059組胞核 Nrf2未見明顯減少，胞漿 Nrf2未見明顯改變。Western顯示，與BDMC+STS組相比，BDMC+STS+LY294002組核Nrf2水平減少，胞漿Nrf2水平升高(P＜0.05，n=5)，而 BDMC+ST

13、S+PD98059組細胞漿Nrf2水平與 BDMC+STS組相比無差異（P＞0.05，n=5），細胞核 Nrf2水平有所下降(P＜0.05，n=5)。
　　8.使用LY294002和PD98059后，與BDMC+STS組相比，BDMC+STS+LY294002組p-Akt的升高水平得到明顯抑制， HO-1的表達顯著下降（P＜0.05，n=5）。而與BDMC+STS組相比，BDMC+STS+PD98059組p-ERK升高水平雖然受到