湘瓊兩地蝙蝠攜帶星狀病毒與諾如病毒的調(diào)查研究.pdf

1、研究背景和目的:研究表明,蝙蝠是多種人獸共患疾病病毒的自然宿主,并可以跨越物種間屏障,將病毒傳播給人類和其他動物。目前研究人員已經(jīng)從蝙蝠身上發(fā)現(xiàn)或分離很多種病毒,約有18個病毒科包含70多種病毒。已知能從蝙蝠傳播給人類的病毒主要有狂犬病毒、尼巴病毒、亨德拉病毒,還有類SARS冠狀病毒,這些病毒都可以引起人類致命性的疾病。其他病毒,如甲病毒屬、黃病毒屬和布尼亞病毒屬病毒可通過節(jié)肢動物傳播給蝙蝠,但還不確定蝙蝠是不是這類病毒所致疾病的播散宿

2、主?？梢?還需要大量研究,以明確蝙蝠在病毒性自然疫源性疾病中所扮演的角色。
　　 我國約有120種蝙蝠,但國內(nèi)對蝙蝠的研究工作起步較晚,對其生態(tài)學(xué)、行為學(xué)研究尚不夠深入,尤其是對我國蝙蝠攜帶哪些種類病毒,以及病毒與蝙蝠生態(tài)學(xué)的關(guān)系,對人類健康的影啊的研究還較少。迄今為止,我國科研工作者對蝙蝠所攜帶病毒的研究有以下發(fā)現(xiàn):從蝙蝠體內(nèi)分離到羅斯河病毒、乙型腦炎病毒、基孔肯雅病毒、森林腦炎病毒、SARS類冠狀病毒、狂犬病病毒、星狀病毒、

3、尼巴病毒等。這些發(fā)現(xiàn)表明我國蝙蝠可攜帶某些我國常見傳染病的病毒。
　　 病毒性胃腸炎(viral gastroenteritis)又稱病毒性腹瀉,是一組由多種病毒引起的急性腸道傳染病。臨床特點為起病急、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉,排水樣便或稀便,也可有發(fā)熱及全身不適等癥狀,病程短,病死率低。病毒性腹瀉在兒童中更是一種常見病和多發(fā)病,是導(dǎo)致兒童死亡的重要原因。引起兒童腹瀉的病毒主要有輪狀病毒(rotavirus)、腸道腺病毒(aden

4、ovirus)、星狀病毒(astrovirus,Astv)、諾如病毒(norovirus,NoV)等。
　　 患者與無癥狀帶毒者是病毒性胃腸炎的主要傳染源。糞-口途徑傳播是病毒性胃腸炎最重要的傳播途徑,少部分可以通過空氣傳播,其可通過被污染的食物或水引起人群胃腸炎暴發(fā)或散發(fā)?；仡櫳鲜兰o90年代的亨德拉病毒和尼帕病毒的暴發(fā)事件,也是源于食源性感染,是由于蝙蝠病毒污染了水域、水果,再依次傳播給馬、豬、人,最后導(dǎo)致疾病暴發(fā)。
　

5、　 星狀病毒(Astrovirus,Astv)于1975年在胃腸炎患兒糞便標本中首次發(fā)現(xiàn),由于電鏡下病毒顆粒呈星形,因此被命名為星狀病毒。此后世界各地均已有星狀病毒感染的報道,它既可散發(fā)也可以引起暴發(fā)流行,亦可引起醫(yī)源性感染。住院腹瀉患兒中星狀病毒檢出率為2.5％～9.0％,目前認為星狀病毒是嬰幼兒病毒性胃腸炎的第二位病因,僅次于輪狀病毒。
　　 星狀病毒既可感染人,也可感染牛、羊、豬、狗、鹿、火雞、鴨、鼠等多種動物,導(dǎo)致不同

6、程度的胃腸炎。人群感染的星狀病毒,傳統(tǒng)上可分為8個血清型。最近,研究者又在腹瀉病人中發(fā)現(xiàn)兩種的新星狀病毒,astrovirus MLB和astrovirus VA。研究還發(fā)現(xiàn),Astv MLB1與新近發(fā)現(xiàn)的鼠星狀病毒很相近；Astv VA1在進化樹上與感染羊和貂的星狀病毒最為接近。這提示新發(fā)現(xiàn)的人星狀病毒可能和動物的星狀病毒存在一定的關(guān)系。
　　 近年來,香港大學(xué)研究小組分別從香港和中國大陸的蝙蝠體內(nèi)檢出星狀病毒,檢出率高達46

7、％和44.8％；基因分析顯示蝙蝠星狀病毒具有高度基因多態(tài)性,部分病毒可能與感染人的星狀病毒有系統(tǒng)進化的關(guān)系。然而關(guān)于蝙蝠星狀病毒的生態(tài)學(xué)資料還很稀少,有必要進一步擴充不同地區(qū)和不同種類的蝙蝠樣本進行研究。
　　 諾如病毒(Norovirus,NoV)是一組杯狀病毒屬病毒,其原型株諾瓦克病毒于1972年在美國諾瓦克市被分離發(fā)現(xiàn)。由于該組病毒極易變異,此后在其他地區(qū)又相繼發(fā)現(xiàn)并命名了多種類似病毒,統(tǒng)稱為諾如病毒。NoV是一種高致病的

8、、傳染性極強的腸胃病毒,能導(dǎo)致急性胃腸炎,一旦有人感染,通常會發(fā)展為群體性的大規(guī)模傳染。遺憾的是,由于病毒的高度變異性及其缺少合適的動物研究模型,現(xiàn)今還未研發(fā)出理想的NoV疫苗,患者容易發(fā)生反復(fù)感染。
　　 自然界中攜帶NoV的物種很多,包括有人、豬、牛、鼠、海獅等,可導(dǎo)致它們發(fā)生不同程度的癥狀。根據(jù)基因特征,NoV被分為五個遺傳群(Gene Group,GG):GGⅠ、GGⅡ、GGⅢ、GGⅣ和GGⅤ。五個遺傳群中,GGⅠ、GG

9、Ⅱ和GGⅣ主要感染人類,GGⅢ感染牛,GGⅤ則在鼠類動物內(nèi)檢出。
　　 雖然研究已表明NoV在多種動物體內(nèi)廣泛存在,但是關(guān)于動物NoV感染的流行病學(xué)還不太清楚。動物NoV在動物體內(nèi)感染率差別較大,研究發(fā)現(xiàn)北美的實驗鼠鼠類NoV的感染率高達22.1％,英國檢測發(fā)現(xiàn)牛的腹瀉病例中有11％比例為NoV感染所致,而豬NoV檢出率比較低,在日本豬GGⅡ NoV的檢測率僅為0.35％,在荷蘭檢測率為2.0％。
　　 盡管現(xiàn)今沒有證據(jù)

10、表明動物NoV可以感染人類,但是分子生物學(xué)分析表明動物NoV和人類NoV的毒株相互之間有密切的關(guān)系,尤其是豬NoV的毒株可被歸入到與人類NoV毒株相同的基因群(GGⅡ)。新近研究發(fā)現(xiàn)豬體內(nèi)普遍存在人NoV的抗體,這進一步加強了動物可能充當著人類NoV儲存庫的假設(shè)。此外,研究還發(fā)現(xiàn)貝殼類動物可同時攜帶人類NoV和動物NoV,這提示一種新的基因重組株可能出現(xiàn)。最近,在加拿大人們檢測到豬NoV和牛NoV的序列與入NoVGGⅡ.4毒株的序列非常

11、接近。因此,將來或許要重新評估NoV種間傳播的可能性及其人畜共患的風險。
　　 2009年,武漢病毒研究所在蝙蝠體內(nèi)檢測到另一種導(dǎo)致人腹瀉的病毒-腸道腺病毒,檢出率為8％(28/350),基因分析顯示蝙蝠腺病毒亦具有高度基因多樣性,這提示蝙蝠可能有攜帶一系列高變異病毒的能力。研究已經(jīng)在蝙蝠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了星狀病毒和腺病毒兩種腹瀉相關(guān)病毒,關(guān)于蝙蝠是否攜帶有NoV,暫未見有文獻報道,因而我們不禁疑問蝙蝠是否攜帶有可導(dǎo)致爆發(fā)流行的NoV。

12、鑒于NoV的高度基因變異性和多宿主性,作為種類第二多的哺乳動物(1000多種)—蝙蝠也很有可能攜帶此類病毒,甚至可能是它們的宿主。
　　 因此,為進一步了解不同地區(qū)不同種類蝙蝠攜帶星狀病毒的本底情況,探討其與感染人星狀病毒的關(guān)系,同時了解這些地區(qū)的蝙蝠是否攜帶諾如病毒,本研究擬在先前未見報道的湖南、海南部分地區(qū)為現(xiàn)場,對當?shù)仳饠y帶星狀病毒和諾如病毒情況進行流行病學(xué)調(diào)查。
　　 研究方法
　　 1.樣本的采集和處

13、理2007年7月至2008年7月,于岳陽、邵陽、?？谌貐^(qū)蝙蝠長期監(jiān)測點中選取4個蝙蝠自然棲息地,現(xiàn)場捕捉蝙蝠,進行編號后,請蝙蝠研究專家進行鑒定。標本采集方式分兩種,分別為采集肛拭子和剪取直腸組織。采集的樣本存放于含200μl RNAlater儲存液的凍存管中,置放于密封的冰袋泡沫盒中當天運回實驗室,放于-80℃冰箱貯存,待檢。
　　 2.蝙蝠病毒的檢測與鑒定
　　 2.1.星狀病毒
　　 ①半巢式PCR篩檢樣

14、本參照文獻,針對星狀病毒高度保守的RdRp基因,設(shè)計合成5條用于巢式PCR的引物,包括4條前引物和1條共同的后引物,應(yīng)用巢式PCR方法檢測標本。
　　 ②序列鑒定與分析對陽性PCR產(chǎn)物進行切膠、純化和回收,然后送樣至公司測序。如遇陽性PCR產(chǎn)物條帶很弱者,則先做克隆,再取接種培養(yǎng)后菌液送樣至公司測序鑒定。
　　 ③將測序結(jié)果導(dǎo)入GenBank的BLAST軟件進行在線同源性分析,然后在GenBank下載相關(guān)核酸序列,利用C

15、lastal X軟件對所要分析的序列進行多序列比對分析,并用DNAstar軟件對核酸序列相似性進行計算。使用MEGA4.1軟件,用Neighbor-Joining法構(gòu)建進化樹進行分析。
　　 2.2.諾如病毒
　　 ①TaqMan real-time PCR檢測基因組Ⅱ型諾如病毒(GGⅡ NoV)參照文獻并合成用于檢測GGⅡ NoV公認的特異引物和探針,利用TaqManreal-time PCR方法對本進行檢測。

16、　　 ②SYBR Green real-time PCR檢測諾如病毒參照文獻合成可檢測NoV的兩對通用引物P289/P290和12Y/13I,應(yīng)用SYBR Green real-time PCR方法分別檢測標本。
　　 ③GGV型NoV特異引物檢測標本參照文獻合成公認的可檢測GGV型NoV引物,應(yīng)用普通RT-PCR方法檢測標本。
　　 ④對普通RT-PCR擴增獲得的可疑陽性PCR產(chǎn)物進行切膠、純化和回收,然后送樣至公司

17、測序。對TaqMan real-time PCR檢測的可疑陽性PCR產(chǎn)物,送樣至公司克隆鑒定。
　　 3.質(zhì)量控制
　　 ①移液槍頭、凍存管、EP管等實驗耗材均為一次性用品。
　　 ②RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄實驗所采用的所有容器和配制試劑用DEPC水處理,高溫高壓處理,烘干待用,以去除RNA酶污染。
　　 ③全程戴口罩、手套、帽子,在無菌室生物安全柜進行操作,防止試劑和實驗過程受到污染。
　　 ④實驗過

18、程嚴格設(shè)立陽性對照、陰性對照和空白對照。
　　 結(jié)果
　　 1.蝙蝠基本情況本次研究在湖南、海南兩省四個監(jiān)測點共采集蝙蝠321只,涉及2個蝙蝠亞目4個蝙蝠科9個種類的蝙蝠。共制備蝙蝠糞便標本321份,包括肛拭子59份和直腸樣本262份。
　　 2.星狀病毒的檢測
　　 ①巢式RT-PCR檢測到陽性標本29例,總陽性率為9.03％(29/321),在9種表面健康的蝙蝠中發(fā)現(xiàn)有3種蝙蝠攜帶有星狀病毒,陽性蝙蝠

19、種類包括長翼蝠(22/187)、小黃蝠(6/38)和棕果蝠(1/59),以小黃蝠的檢出率最高。
　　 ②以星狀病毒RdRp基因部分氨基酸序列構(gòu)建的進化樹分析顯示,本研究檢測的蝙蝠星狀病毒不僅與來源于其他種類的星狀病毒差異較大,而且本身也有很大的差異。然而,有5個蝙蝠星狀病毒卻與羊星狀病毒(ovine Astv)、貂星狀病毒(mink Astv)和人新型星狀病毒Astv VA在進化樹上最為相近,序列相似性為51.6％-63.1％。

20、另外,有8株從邵陽地區(qū)同一個洞穴長翼蝠檢測到的星狀病毒相聚在一小分支,它們的氨基酸序列相似性為97％-99％。
　　 3.諾如病毒的檢測本研究采用TaqMan real-time PCR、SYBR Green real-time PCR和普通RT-PCR三種實驗方法,應(yīng)用多對引物分別篩查上述蝙蝠糞便樣本GGⅠ～Ⅳ型NoV攜帶情況,檢測結(jié)果均為陰性。
　　 結(jié)論
　　 ①巢式PCR檢測到星狀病毒陽性率為9.03％(

21、29/321),并首次在果蝠身上檢出星狀病毒(1/59),提示此類星狀病毒可能適應(yīng)于翼手目動物,盡管不同種類的蝙蝠對它的易感程度不一。
　　 ②本研究檢出的蝙蝠星狀病毒基因多態(tài)性豐富,這結(jié)果與先前研究一致。5株蝙蝠星狀病毒卻與羊星狀病毒、貂星狀病毒、人星狀病毒AStv VA在進化樹上最為相近,并具有較高的氨基酸序列相似性。這提示蝙蝠星狀病毒可能跨種族傳播給人類或其他動物,亦或是在它們之間相互傳播。
　　 ③來自邵陽同一個