蝙蝠乙腦病毒的檢測(cè)方法研究和攜帶狀況調(diào)查.pdf

1、研究背景和目的：
　　 乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV，簡(jiǎn)稱乙腦病毒)是流行性乙型腦炎(簡(jiǎn)稱乙腦)的病原體，屬于黃病毒屬。乙腦是經(jīng)蚊蟲媒介叮咬傳播而引起的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的急性傳染病，是對(duì)人畜危害較大的一種自然疫源性疾病，并可造成嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥?！拔?動(dòng)物-蚊”是乙型腦炎病毒在自然循環(huán)的基本環(huán)節(jié)。乙腦在世界許多國(guó)家均有流行的報(bào)道，我國(guó)是高發(fā)區(qū)，全國(guó)除東北北部、青海、新疆、西

2、藏外均有乙腦流行，局部地區(qū)有爆發(fā)或流行。
　　 目前乙腦病毒的檢測(cè)主要有病毒分離法、血清學(xué)方法和分子生物學(xué)檢測(cè)方法等。病毒分離法是金標(biāo)準(zhǔn)方法，但敏感性較差，且操作步驟繁瑣復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)。血清學(xué)方法操作相對(duì)簡(jiǎn)便、快速，但血清學(xué)方法的不足是不能獲得病原體的詳細(xì)生物學(xué)信息。分子生物學(xué)檢測(cè)方法因?yàn)槠涿舾?、特異并能得到病原體的基因做進(jìn)一步分析，因此得到廣泛應(yīng)用。PCR方法有多種，各有利弊，因此須根據(jù)實(shí)際情況選擇。2000年日本學(xué)者Noto

3、mi等發(fā)明了一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等溫條件保溫?cái)?shù)十分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。該方法步驟簡(jiǎn)單，擴(kuò)增RNA只要在反應(yīng)體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶，就能完全像DNA基因擴(kuò)增那樣，一步實(shí)現(xiàn)RNA擴(kuò)增；靈敏度高，擴(kuò)增模板可達(dá)幾個(gè)拷

4、貝；快速、高效擴(kuò)增，整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)在不到1h即可完成；高特異性，4條引物對(duì)靶序列的6個(gè)特異序列區(qū)的識(shí)別，可根據(jù)是否擴(kuò)增來判斷目標(biāo)基因的存在與否：結(jié)果鑒定簡(jiǎn)便，可以采用肉眼觀察反應(yīng)液的顏色變化來迅速判定，也可以通過瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察有無特異性梯狀條帶來判別結(jié)果。目前很多實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立LAMP方法檢測(cè)病原體，有兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室也報(bào)道了建立逆轉(zhuǎn)錄LAMP(RT-LAMP)方法檢測(cè)乙腦病毒，表明敏感性和特異性均能達(dá)到常規(guī)RT-PCR水平，但未

5、見與逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time RT-PCR)比較的報(bào)道，而Real-time PCR是目前公認(rèn)的敏感性最高的PCR方法。
　　 蝙蝠是哺乳類中分布最廣、數(shù)量最多的動(dòng)物之一，屬翼手目，分大蝙蝠亞目和小蝙蝠亞目，全世界約有1107種。除南北極外，蝙蝠在世界各地都有分布，包括在高緯度地區(qū)、孤立的島嶼和荒涼的沙漠等，然而大部分種類生活在熱帶和亞熱帶地區(qū)。迄今為止已在蝙蝠體內(nèi)分離出80多種病毒，其中一些是人獸共患病病毒

6、，人類一些新病毒傳染病的爆發(fā)也被證實(shí)與蝙蝠有關(guān)，如1994年澳大利亞爆發(fā)的亨德拉病毒(Hendra virus)感染、1998年馬來西亞爆發(fā)的尼巴病毒(Nipah virus)感染等。國(guó)內(nèi)外學(xué)者也有從蝙蝠體內(nèi)分離出乙型腦炎病毒的報(bào)道，一些種類蝙蝠因棲息地點(diǎn)或覓食等生活習(xí)性，如捕食蚊、蠅等，與人類接觸密切，因而這些蝙蝠可能在乙腦病毒的保存和擴(kuò)散中起重要作用。過去兩年中，我們已經(jīng)在我國(guó)南方一些省份發(fā)現(xiàn)一些種類的蝙蝠可攜帶乙腦病毒，但研究的內(nèi)

7、容和范圍仍很局限，仍然需要更多的研究和科學(xué)證據(jù)。
　　 為深入研究蝙蝠在傳播乙腦病毒中的作用，在本研究中，我們建立了乙腦病毒RT-LAMP檢測(cè)方法，并與RT-PCR及Real-time RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行了比較，以期為蝙蝠乙腦病毒的快速檢測(cè)提供一種更為簡(jiǎn)便的方法。同時(shí)，我們繼續(xù)從海南、廣東和湖南省部分地區(qū)收集蝙蝠標(biāo)本，調(diào)查蝙蝠攜帶乙腦病毒的狀況。
　　 研究方法
　　 1.乙腦病毒RT-LA肝檢測(cè)方法的建立

8、
　　 1.1 LAMP引物設(shè)計(jì)
　　 從GeneBank中獲得乙腦病毒(strain JaOArS982)E基因區(qū)序列，利用在線Primer Explorer version 3.0軟件，根據(jù)LAMP引物設(shè)計(jì)的原則，設(shè)計(jì)RT-LAMP檢測(cè)方法所用的6條引物，包括內(nèi)引物(FIP、BIP)，外引物(F3、B3)和環(huán)引物(LoopF、Loop B)各1對(duì)。
　　 1.2乙腦病毒RT-LAMP檢測(cè)方法反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

9、
　　 根據(jù)反應(yīng)體系優(yōu)化策略，對(duì)Bst DNA聚合酶(8U/μL)、SuperScdptⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/μL)、dNTP mix(10mM)、Betaine(5M)、MgCl2(50mM)、6條引物等成分進(jìn)行優(yōu)化和調(diào)整。
　　 依據(jù)Tm值，將溫度按60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃依次遞增，從多次重復(fù)試驗(yàn)中確定最佳退火溫度。
　　 1.3乙腦病毒RT-LAMP檢測(cè)方法特異性測(cè)試
　　 以

10、登革2型病毒、諾如病毒、EV71病毒、星狀病毒、犬五聯(lián)減毒活疫苗的核酸為陰性對(duì)照樣品，同時(shí)設(shè)立提取的乙型腦炎病毒核酸為陽(yáng)性對(duì)照，DEPC-Water為空白對(duì)照，檢驗(yàn)乙型腦炎R(shí)T-LAMP方法的特異性。
　　 1.4乙腦病毒RT-LAMP檢測(cè)方法敏感性測(cè)試
　　 對(duì)定量的乙腦病毒核酸樣品，進(jìn)行10倍系列稀釋，分別稀釋至1：1×1O1～1：1×108，采用建立的RT-LAMP方法進(jìn)行檢測(cè)。
　　 1.5乙腦病毒RT-

11、PCR及Real-time RT-PCR平行檢測(cè)
　　 將10倍系列稀釋的乙腦病毒核酸樣品，平行作RT-PCR及Real-time RT-PCR檢測(cè)。
　　 2.蝙蝠標(biāo)本的收集與處理
　　 2008年7月至2009年8月期間，在海南、廣東和湖南省部分地區(qū)收集蝙蝠標(biāo)本，進(jìn)行編號(hào)后，請(qǐng)廣州大學(xué)生命科學(xué)院蝙蝠研究專家吳毅教授進(jìn)行種類鑒定。采集蝙蝠的地點(diǎn)主要有野外陰濕的山洞和棕櫚、椰子樹葉叢。通過無菌操作解剖蝙蝠，取腦組

12、織標(biāo)本，分別保存在含有RNAlater、PBS的凍存管中，采用冰袋泡沫箱，經(jīng)12小時(shí)運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室，放入-80℃保存，待檢。
　　 3.蝙蝠腦組織乙腦病毒的檢測(cè)
　　 3.1 TaqMan Real-time RT-PCR法檢測(cè)乙腦病毒
　　 ①根據(jù)GenBank中發(fā)布的JEV非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS3基因序列，結(jié)合生物信息學(xué)分析軟件比對(duì)分析，參考相關(guān)文獻(xiàn)資料，遵循引物和探針設(shè)計(jì)的原則，利用Primer Express

13、Software V3.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針序列。
　　 ②利用TaqMan Real-time RT-PCR-法檢測(cè)蝙蝠腦組織中的乙腦病毒。
　　 3.2 RT-PCR法檢測(cè)乙腦病毒
　　 ①參考GeneBank發(fā)表的乙腦病毒基因序列，針對(duì)病毒保守基因E基因，遵循引物設(shè)計(jì)的原則，保證引物的合理性和科學(xué)性，設(shè)計(jì)了一對(duì)常規(guī)RT-PCR引物。
　　 ②利用普通RT-PCR法檢測(cè)蝙蝠腦組織中的

14、乙腦病毒。
　　 3.3 RT-LAMP方法檢測(cè)蝙蝠腦組織乙腦病毒
　　 經(jīng)Taqman探針法檢測(cè)乙腦病毒陽(yáng)性的蝙蝠腦組織樣本，用本次研究建立的RT-LAMP方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)做陽(yáng)性對(duì)照。
　　 3.4乳鼠接種病毒增殖實(shí)驗(yàn)
　　 將可疑陽(yáng)性檢測(cè)樣本和陽(yáng)性對(duì)照樣本，接種3日齡的昆明乳鼠腦內(nèi)進(jìn)行病毒增殖。發(fā)病乳鼠會(huì)有拒乳、弓背、抽搐、嗜睡、行走不穩(wěn)等癥狀，待發(fā)病乳鼠瀕臨死亡時(shí)，無菌解剖取腦組織。若觀察一周后，

15、無癥狀出現(xiàn)，則連續(xù)盲傳三代，仍未出現(xiàn)發(fā)病癥狀，且經(jīng)檢測(cè)后，判為陰性。
　　 3.5細(xì)胞培養(yǎng)
　　 將蝙蝠腦組織研磨液上清接種于已培養(yǎng)好長(zhǎng)成單層細(xì)胞的BHK-21細(xì)胞，加入已配置好的MEM混合液，置于37℃、5％CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)變化和RT-PCR方法檢測(cè)，判斷結(jié)果。
　　 4.質(zhì)量控制
　　 ①移液槍頭、EP管、凍存管、手套等實(shí)驗(yàn)耗材均為一次性用品；
　　 ②逆轉(zhuǎn)錄

16、過程采用的移液槍頭、EP管和研磨器用DEPC處理，高溫高壓消毒，烤干后待用，以去除RNA酶污染；
　　 ③RNA的提取，RT-PCR的反應(yīng)體系的試劑加樣均在無菌間生物安全柜進(jìn)行操作，防止環(huán)境中RNA酶的污染；
　　 ④操作過程中，全程戴口罩、帽子，勤換手套，防止樣本和試劑受到來自操作者攜帶的RNA酶污染；
　　 ⑤實(shí)驗(yàn)過程中均設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
　　 結(jié)論
　　 1.本研究建立的乙腦病毒RT