我國南方部分地區(qū)蝙蝠攜帶狂犬病毒的病原生態(tài)學(xué)研究.pdf

1、狂犬病是由狂犬病毒(Rabies virus，RABV)引起的一種人獸共患自然疫源性疾病，死亡率幾乎為100％。在發(fā)達(dá)國家，人的狂犬病已極為罕見甚至完全消除，犬已經(jīng)不再是狂犬病傳播的主要媒介。我國人狂犬病的發(fā)病數(shù)位居世界第二，2002年以來年度發(fā)病及死亡人數(shù)均超過2000例，是嚴(yán)重危害我國公共衛(wèi)生安全的重要疫病。從建國初至今，我國對動物狂犬病未進(jìn)行過系統(tǒng)的流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)。因此針對狂犬病的自然宿主——蝙蝠開展RABV的病原生態(tài)學(xué)研究，對于闡

2、明我國蝠源RABV的分布及遺傳衍化關(guān)系具有重要意義，對于預(yù)警、減少或消滅狂犬病對人類的威脅，具有重要的公共衛(wèi)生意義。 正確的狂犬病流行病學(xué)研究方法離不開制定合理有效的調(diào)查程序，包括樣品的采集、背景資料的收集整理、研究方法的選擇和研究結(jié)果的分析。為了獲得中國部分地區(qū)蝙蝠狂犬病的流行資料，我們首先制定了蝙蝠狂犬病流行病學(xué)研究的樣品采集方案，依據(jù)衛(wèi)生部發(fā)布的人狂犬病疫情公報(bào)，將南方狂犬病高發(fā)區(qū)確定為重點(diǎn)調(diào)查采樣的地區(qū)。最終在中國南方4

3、省(廣東省、廣西省、云南省和海南省)14個地區(qū)和北方吉林省的長春共采集了4科12個蝙蝠品種的1387只外表健康蝙蝠進(jìn)行了本次病原流行病學(xué)調(diào)查。至課題完成，共獲得蝙蝠腦組織樣品1287份，蝙蝠血清樣品732份。在上述樣品的采/收集時，我們均建立了嚴(yán)格的樣品登記制度，詳細(xì)記錄了全部樣品的明細(xì)檔案資料，包括采集當(dāng)?shù)氐目袢×餍星闆r、RABV 易感動物種群及分布、人文環(huán)境等，同時還建立了嚴(yán)格的檔案登記制度，詳細(xì)記錄了與樣品相關(guān)的流行病學(xué)信息，這

4、些資料的收集整理對于后期的數(shù)據(jù)分析以及防控政策的制定都具有重要意義。 引起狂犬病的RABV是彈狀病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒屬(Lyssavirus)的成員，作為單股負(fù)鏈RNA病毒，其核蛋白(N)的編碼基因——N基因由于型間相對保守和復(fù)制過程中的高拷貝的特點(diǎn)，成為病毒分型和分子診斷的目標(biāo)序列?，F(xiàn)已采用系統(tǒng)發(fā)生分析的方法將己發(fā)現(xiàn)的RABV確定為7個基因型，此外尚有4種待分型。目前我國狂犬病毒野外分離株僅限于基因Ⅰ型

5、，但是考慮到我國地處歐亞大陸，地理環(huán)境和多種野生動物棲息的生態(tài)環(huán)境，使我們有理由懷疑我國可能存在其他基因型的狂犬病毒，即狂犬相關(guān)病毒(Rabies-related virus，RRV)。為了快速完成批量樣品/不同品質(zhì)樣品的RABV檢測，我們參考了不同基因型狂犬病毒的N基因序列，設(shè)計(jì)了nested RT-PCR 引物并建立了檢測方法。靈敏度試驗(yàn)表明，所建立的nested RT-PCR方法可檢出0.2TCID<,50>的SRV9細(xì)胞毒；靈敏

6、度較MIT法高出100倍。特異性試驗(yàn)表明，本方法可以擴(kuò)增狂犬病毒的全部基因型的毒株；可供檢測的樣品包括犬源、牛源、豬源、羊源、蝙蝠源的組織樣品，可以用于我國狂犬病毒易感動物帶毒的篩查。該方法已在國內(nèi)多家獸醫(yī)疾病監(jiān)控部門應(yīng)用，反饋效果很好。通過對所收/采集到的動物樣品的病原學(xué)檢測，獲得蝠源RABV N 基因部分序列79條，蝠源RABV G基因部分序列19條。檢測結(jié)果證實(shí)，廣東蝙蝠腦組織RABV感染陽性率為8.22％(60/730)，廣西蝙

7、蝠腦組織陽性率為3.72％(11/296)，云南蝙蝠腦組織陽性率為7.14％(2/28)，海南蝙蝠腦組織陽性率為2.58％(6/233)。在對蝠源RABV序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析時，我們參考了GenBank收集的我國及世界范圍RABV流行株、固定毒株及RRV的基因序列。結(jié)果表明，我國蝠源RABV的79條N基因部分序列，核苷酸的最低同源性達(dá)81.7％，氨基酸的最低同源性為89.4％。多序列比較證實(shí)不同地域毒株問變異的核苷酸位點(diǎn)和氨基酸位點(diǎn)具有

8、明顯的規(guī)律性；系統(tǒng)發(fā)生分析表明，這些毒株歸屬為三個進(jìn)化群：Ⅰa、Ⅰb和Ⅰc；群內(nèi)地域性特征明顯，且同源關(guān)系較近。結(jié)合參考序列數(shù)據(jù)，證明我國動物源RABV均為基因Ⅰ型，可以劃分為5個群，除蝠源RABV獨(dú)立的三個群外，其他動物源RABV尚組成2個群；世界蝠源RABV流行株地域性分群明顯，群間地域性分布與大陸架結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，中國流行株在其中表現(xiàn)出明顯的地域性與進(jìn)化程度上的保守性。對蝠源 RABV與動物源性RABV G基因的系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果表明

9、我國蝠源RABV G基因與我國和其他國家動物源性RABV G基因親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這可能是我國蝙蝠鮮有傳播RABV的原因。 為調(diào)查我國蝙蝠感染RABV的情況，本研究利用FITC-Protein A與FITC-ProteinG 混合物作為熒光二抗，建立了能夠檢測蝙蝠血清抗體的間接免疫熒光染色法(indirect fluorescent antibody test，iFAT)，應(yīng)用該方法和改良的熒光抗體病毒中和試驗(yàn)(modified F

10、AVN，mFAVN)對我國5個省的11個地區(qū)的732份蝙蝠血清樣品進(jìn)行了狂犬病毒抗體檢測。結(jié)果表明，被檢地區(qū)的蝙蝠血清中RABV抗體陽性率為3.28％(24/732)。所檢測的4科8個品種的蝙蝠中有4個品種呈RABV感染陽性，其中棕果蝠(Rousettus leschenaulti)和水鼠耳蝠(Myotis daubentoni)是感染較為普遍的蝙蝠品種。此外，以熒光抗體病毒中和試驗(yàn)(fluorescent antibody virus

11、 neutralization test，F(xiàn)AVN)對 iFAT 檢測的、血清量足夠的15份陰性和3份陽性棕果蝠血清樣品進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果3份陽性血清也表現(xiàn)出中和抗體陽性，其中和抗體水平分別為：0.15IU/mL，0.08IU/mL，0.33IU/mL，15份陰性血清無中和抗體，檢測符合率達(dá)100％。以mFAVN方法檢測了74份小菊頭蝠(Rhioophus blythi)血清，2份呈陽性，中和抗體水平均為0.38IU/mL，在這74份血清中