五甲基槲皮素促進白色脂肪棕色-米色化的作用及機制研究.pdf

1、基于對脂肪可塑性的深入了解，促進白色脂肪棕色/米色化已被認為是治療肥胖及相關疾病的有希望的研究方向，相關領域的藥物研發(fā)備受關注。五甲基槲皮素（Pentamethylquercetin，PMQ）屬于天然多甲氧基黃酮類化合物中的一員，主要存在于沙棘果實和山柰屬植物根莖等天然植物中，受資源限制，研究甚少。本實驗室采取半合成的方法，對槲皮素進行全甲基化修飾得到PMQ，從而解決了藥源瓶頸問題。PMQ已被證實具有抗代謝綜合征、抗糖尿病、抗心肌肥厚及

2、抗血栓形成等藥理活性。我們之前雖已證明PMQ具有誘導白色脂肪向棕色脂肪轉變的作用，但其機制有待深入研究。本研究采用谷氨酸鈉誘導的肥胖（Monosodium glutamate-induced obesity,MSGIO）小鼠模型及3T3-L1脂肪細胞模型，在整體和細胞水平進一步探討PMQ促進白色脂肪棕色/米色化的作用和機制。
　　第一部分：PMQ促進MSGIO小鼠白色脂肪棕色/米色化
　　目的：研究PMQ對MSGIO小鼠白色

3、脂肪棕色/米色化作用。
　　方法：制備MSGIO小鼠模型，5周齡時，隨機分為Control組、MSGIO組、PMQ各劑量組（5、10、20mg/kg/d），共5組，各組小鼠灌胃給藥，每日一次，第22周齡時進行口服糖耐量實驗（OGTT）。24周齡時，測量各組小鼠體重、腰圍、體長，經眼眶靜脈叢采血后宰殺小鼠，獲取相應組織器官。檢測各組小鼠的血清葡萄糖、甘油三脂（TG）、總膽固醇（TC）、胰島素水平并計算胰島素抵抗指數（HOMA-IR）

4、；腹股溝脂肪行HE染色，免疫組化；通過RT-PCR法，檢測各組小鼠腹股溝脂肪棕色化基因及米色化基因表達；Western blot法檢測各組小鼠腹股溝脂肪UCP-1蛋白水平。
　　結果：(1)與Control組相比，MSGIO小鼠呈現明顯肥胖，體重、腰圍、Lee指數、脂肪總重及脂肪指數分別增加45％、29%、33%、282%和179%。MSGIO小鼠出現糖脂代謝異常，血糖、TG、TC分別升高51%、120%和96%。MSGIO小鼠出

5、現高胰島素血癥、胰島素抵抗及糖耐量受損，表現為血清胰島素升高3.3倍、胰島素抵抗指數升高5.6倍、OGTT曲線下面積（AUC）增加60%。上述結果確證MSGIO小鼠是典型的肥胖型2型糖尿病模型。(2)相比Control組，MSGIO小鼠腹股溝脂肪細胞體積明顯增加，多為大脂滴單房細胞，棕色化基因Ucp-1、Pgc-1α、Cidea和Cox-7a1mRNA表達分別下調46%、42%、34%和26%，米色化基因Cd137、Tbx-1和Tmem

6、26分別降低60%、49%和56%，UCP-1+脂肪細胞較少及UCP-1蛋白表達減少45%。結果提示肥胖型2型糖尿病導致白色脂肪組織的棕色/米色化潛能降低。(3)PMQ劑量依賴性降低MSGIO小鼠的體重、腰圍、Lee指數、脂肪總重及脂肪指數，其中PMQ20mg/kg組降低這些指標分別為16%、8%、4%、20%和10%?？崭寡恰⒀錞G、TC、血清胰島素、HOMA-IR指數及AUC均劑量依賴性降低，PMQ20mg/kg可使這些指標達到

7、或接近達到Control組水平。結果表明，PMQ的療效滿足減肥藥物的1級和2級終點要求。(4)與MSGIO小鼠相比，PMQ各給藥組降低腹股溝脂肪細胞體積，多為小脂滴多房細胞；PMQ可劑量依賴性升高腹股溝脂肪棕色化基因（Ucp-1、Pgc-1α、Cidea、Cox-7a1）和米色化基因（Cd137、Tbx-1、Tmem26）mRNA水平及UCP-1蛋白表達，20mg/kg可使全部指標達到Control組水平。表明PMQ增加MSGIO小鼠腹

8、股溝脂肪棕色/米色化表型。
　　第二部分：PMQ誘導白色脂肪棕色/米色化機制研究
　　目的：在整體和細胞水平上研究PMQ誘導白色脂肪向棕色/米色脂肪轉變的作用機制。
　　方法:采用RT-PCR和Western blot法分析腓腸肌AMPK-PGC-1α-FNDC5表達及ELISA檢測血清鳶尾素（irisin）；PMQ（1、3、10μM）干預C2C12肌管細胞，Western blot及ELISA法分析AMPK-PGC-

9、1α-FNDC5蛋白表達和肌管細胞條件化培養(yǎng)基（MCM）中irisin水平；收集MCM-PMQ及Anti-FNDC5中和處理MCM-PMQ10（實驗分組：MCM-Vehicle、MCM-PMQ1/3/10、MCM-PMQ10+anti-FNDC5），用以干預3T3-L1細胞，RT-PCR及Western blot法分別分析3T3-L1脂肪細胞棕色、米色化基因及UCP-1蛋白表達；采用RNA干擾抑制C2C12細胞PGC-1α基因，West

10、ern blot及ELISA法分析PMQ對PGC-1α-FNDC5表達、irisin水平及MCM對UCP-1表達影響；采用AMPK抑制劑（Compound C）處理細胞，Western blot法分析PMQ對AMPK-PGC-1α-FNDC5表達影響。
　　結果：(1)與Control組相比，在mRNA和蛋白質水平上，MSGIO小鼠腓腸肌FNDC5分別下調34%和45%，PGC-1α分別下調38%和34%。MSGIO小鼠血清iri

11、sin水平降低52%，腓腸肌P-AMPK/AMPK比值下調49%。提示在肥胖型2型糖尿病小鼠，腓腸肌AMPK-PGC-1α-FNDC5通路表達及血清irisin水平均明顯下調。(2)與MSGIO小鼠相比，PMQ劑量依賴性上調腓腸肌PGC-1α和FNDC5的mRNA和蛋白表達及血清irisin水平，同時PMQ還劑量依賴性增加MSGIO小鼠腓腸肌P-AMPK表達，PMQ20mg/kg完全矯正肥胖導致的AMPK-PGC-1α-FNDC5通路表

12、達下調及irisin水平降低，使其恢復至Control水平。表明PMQ可激活骨骼肌AMPK-PGC-1α-FNDC5信號通路，刺激irisin分泌。(3)PMQ可濃度依賴性刺激C2C12肌管細胞FNDC5蛋白表達及irisin釋放。PMQ孵育后的MCM濃度依賴性上調3T3-L1脂肪細胞棕色化基因（Ucp-1、Pgc-1α、Cidea、Cox-7a1）和米色化基因（Cd137、Tbx-1、Tmem26）mRNA水平及UCP-1蛋白表達，用

13、Anti-FNDC5抗體處理MCM-PMQ10后，部分拮抗或完全取消MCM-PMQ10對3T3-L1脂肪細胞棕色/米色因子的上調作用。表明PMQ通過FNDC5/irisin通路介導白色脂肪棕色/米色化作用。(4)PMQ可劑量依賴性上調C2C12肌管細胞PGC-1α蛋白表達；C2C12細胞PGC-1α沉默后，消除PMQ對PGC-1α、FNDC5蛋白表達和irisin分泌的促進作用，MCM-PMQ10上調3T3-L1脂肪細胞UCP-1蛋白表

14、達的作用被完全取消。表明PMQ通過上調PGC-1α/FNDC5/irisin，從而上調脂肪細胞UCP-1蛋白表達。(5)在C2C12肌管細胞上，PMQ劑量依賴性升高其p-AMPK水平；Compound C干預后，PMQ上調P-AMPK、PGC-1α和FNDC5蛋白表達的作用均被全部取消。表明PMQ通過激活AMPK上調PGC-1α-FNDC5信號通路。
　　結論：(1)在肥胖型2型糖尿病小鼠模型（MSGIO）白色脂肪組織的棕色/米色