乙型肝炎病毒腫瘤蛋白細(xì)胞靶標(biāo)HBXIP負(fù)向調(diào)控Toll樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　研究HBXIP在LPS誘導(dǎo)的TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮的作用;闡明HBXIP在TLR4轉(zhuǎn)運(yùn)和降解過(guò)程中的重要作用及其機(jī)制。
　　方法:
　　1.構(gòu)建pcmv-mHBXIP真核表達(dá)質(zhì)粒，并測(cè)序鑒定。
　　2.定量PCR與Western blot的方法檢測(cè)HBXIP的表達(dá)規(guī)律，分析LPS刺激下HBXIP的表達(dá)變化。
　　3.以小鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7為細(xì)胞模型，建立HBXIP高表達(dá)和表達(dá)抑制的

2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，用定量PCR和Western blot的方法鑒定HBXIP高表達(dá)和表達(dá)抑制的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。
　　4.用定量PCR和ELISA方法檢測(cè)HBXIP高表達(dá)的Raw264.7細(xì)胞系以及HBXIP表達(dá)抑制的Raw264.7細(xì)胞系中IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β等炎癥因子的表達(dá)情況;用Western blot的方法檢測(cè)LPS誘導(dǎo)下NF-κB信號(hào)通路以及MAPKs信號(hào)通路的變化（包括IKKα/β、IκBα、p65

3、、JNK、Erk、p38、IRF3等）。
　　5.通過(guò)免疫共沉淀的方法，檢測(cè)HBXIP和TLR4的直接作用;通過(guò)FACS分析巨噬細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)變化;通過(guò)Western blot的方法檢測(cè)TLR4蛋白水平，用定量PCR檢測(cè)TLR4的轉(zhuǎn)錄水平變化。
　　6.通過(guò)Western blot的方法檢測(cè)HBXIP高表達(dá)的Raw264.7細(xì)胞系以及HBXIP表達(dá)抑制的Raw264.7細(xì)胞系中LC3Ⅱ的表達(dá)情況以及mTOR信號(hào)通路的

4、變化。
　　7.采用流式細(xì)胞術(shù)分析HBXIP對(duì)巨噬細(xì)胞溶酶體數(shù)量以及溶酶體pH的影響。
　　8.利用激光共聚焦，定位分析HBXIP高表達(dá)的Raw264.7細(xì)胞系以及HBXIP表達(dá)抑制的Raw264.7細(xì)胞系中TLR4與溶酶體以及自噬小體的共定位。
　　9.Western blot方法檢測(cè)HBXIP對(duì)巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factorEB，TEFB)的磷酸化水平的影響;利用激光共聚焦分析HB

5、XIP對(duì)TFEB核轉(zhuǎn)位的影響。
　　10.電鏡觀察HBXIP高表達(dá)和表達(dá)抑制的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中溶酶體的形態(tài)。
　　11.用TFEB siRNA，Rab7 siRNA，mTORC1的激動(dòng)劑Cycloheximide(CHX)，溶酶體活性抑制劑Chloroquine diphosphate(CQ)，自噬溶酶體融合抑制劑Vinblastine處理巨噬細(xì)胞，Western blot方法檢測(cè)HBXIP對(duì)TLR4蛋白水平的影響。

6、　　結(jié)果:
　　1.HBXIP在LPS的刺激下呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。
　　2.HBXIP能夠使IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β等促炎因子的表達(dá)顯著下調(diào)，HBXIP能減弱LPS誘導(dǎo)下NF-κB信號(hào)通路以及MAPKs信號(hào)通路的磷酸化。
　　3.HBXIP對(duì)TLR4的蛋白水平有靶向調(diào)控作用，HBXIP過(guò)表達(dá)能夠顯著抑制TLR4的蛋白表達(dá)。
　　4.HBXIP過(guò)表達(dá)能促進(jìn)LC3Ⅱ的表達(dá)，抑制mTOR信號(hào)通路的相關(guān)蛋

7、白的表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞自噬。
　　5.HBXIP過(guò)表達(dá)能減少TFEB的磷酸化水平，促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位，從而影響溶酶體的數(shù)量和功能。過(guò)表達(dá)HBXIP后，再用自噬溶酶體相關(guān)抑制劑處理，HBXIP對(duì)TLR4的下調(diào)作用消失。
　　結(jié)論:
　　HBXIP通過(guò)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子TFEB的活化，提高了溶酶體以及自噬溶酶體的活性，促進(jìn)TLR4的內(nèi)吞和降解，抑制了LPS誘導(dǎo)的IL-6，IL-1β，TNF-α以及IFN-β炎癥因子的分泌。我們認(rèn)為HB