LPS處理對(duì)肉雞FTO表達(dá)的影響、機(jī)制及其功能分析.pdf

1、本文在肉雞上應(yīng)用LPS引起全身性炎癥反應(yīng)，研究FTO在肝臟及下丘腦中表達(dá)的變化、其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，以及可能的功能。
　　1、LPS對(duì)肉雞肝臟及下丘腦中FTO表達(dá)的影響
　　取廣州溫氏土雞種蛋150枚，按照標(biāo)準(zhǔn)孵化程序孵化。出雛后第28天，采取腹腔注射的方式，試驗(yàn)組注射0.5 mg/kg體重劑量的LPS，對(duì)照組注射相同體積的生理鹽水。注射后2h及24h采集肝臟、下丘腦及抗凝血，分離血漿。LPS處理后1小時(shí)實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物即出現(xiàn)精神萎靡

2、、飲水和進(jìn)食頻率下降的癥狀。LPS注射后2h，肝臟中TLR2（Toll-like receptor）、4、7及TLR21的mRNA表達(dá)均顯著降低(P＜0.05)，而這些基因在下丘腦中的表達(dá)均未受到影響。LPS注射24h后，肝臟中TLR2、4及TLR5的mRNA表達(dá)均顯著降低（P＜0.05），而TLR2在下丘腦中的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組卻顯著升高(P＜0.01)，其他TLRs的表達(dá)依然沒有變化。LPS注射2h后，肝臟中促炎細(xì)胞因子IL(inte

3、rleukin)-1β、IL-6、IL-8、IL-12、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS）以及抗炎細(xì)胞因子IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growthfactor-β，TGFβ)的基因表達(dá)均顯著升高(P＜0.01)。而在下丘腦，只有IL-1β、IL-8以及TGFβ的表達(dá)受到了LPS注射的影響，其中IL-1β(P＜0.01)和IL-8（P＜0.05）的表達(dá)顯

4、著升高，而TGFβ的表達(dá)顯著降低(P＜0.01)。LPS處理24 h后，在肝臟中檢測(cè)的細(xì)胞因子，只有IL-1β和iNOS的表達(dá)受到影響，其中前者顯著升高（P＜0.05），而后者則顯著降低（P＜0.01）。在下丘腦中只有TGFβ的表達(dá)相比與對(duì)照組顯著升高，其他檢測(cè)到的細(xì)胞因子表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組則沒有差異。
　　LPS腹腔注射后2h及24 h，肉雞的肝體比均顯著升高（P＜0.05）;注射后24 h肝臟中甘油三酯的含量顯著升高(P＜0.0

5、5);注射后2h血漿中的甘油三酯(P=0.09)以及注射后24 h血漿中的總膽固醇(P=0.09)含量都有上升的趨勢(shì);血漿中的葡萄糖水平在注射后2h顯著升高（P＜0.01）。肝臟中糖脂代謝相關(guān)的基因表達(dá)也受到影響，其中包括脂肪酸代謝相關(guān)基因肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(carnitine palmitoyl transferase，CPT1)(P＜0.05)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(sterol regulator element binding

6、protein1，SREBP1)(P＜0.01)，膽固醇代謝相關(guān)基因膽固醇-7α羥化酶(cholesterol-7alpha-hydroxylase，CYP7A1)（P＜0.01）、法尼酯X受體(farnesoid X receptor, FXR)(P＜0.01)、低密度脂蛋白膽固醇受體（low density lipoprotein receptor, LDLR）(P＜0.05)以及糖異生相關(guān)基因糖皮質(zhì)激素受體（glucocortic

7、oid receptor, GR）(P＜0.05)和果糖-1，6-二磷酸酶（fructose-1，6-bisphosphatase，F(xiàn)BP1）(P＜0.05)。除FXR的基因表達(dá)顯著上升外，其他基因的表達(dá)均顯著降低，且這些差異均發(fā)生在LPS注射后2h。LPS注射后24 h，所檢測(cè)的所有糖脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組均沒有差異。
　　檢測(cè)兩個(gè)組織FTO的基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)，LPS注射后2h及24 h，肝臟中FTO的基因表達(dá)均顯著降低（

8、P＜0.05），而下丘腦中FTO的表達(dá)則未受到影響。本部分結(jié)果提示，本文所采用的LPS注射劑量及注射方式引起了肉雞全身性炎癥反應(yīng)，下丘腦和肝臟炎癥相關(guān)基因表達(dá)對(duì)LPS處理的應(yīng)答模式不同，提示炎癥反應(yīng)具有組織差異。肉雞肝臟的糖脂代謝受到影響，而FTO的表達(dá)變化呈現(xiàn)出組織特異性。
　　2、LPS影響肉雞肝臟中FTO表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
　　在前面的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LPS腹腔注射能夠降低肝臟FTO的基因表達(dá)，而對(duì)下丘腦中FTO的表達(dá)沒有影響。

9、在大鼠上的研究發(fā)現(xiàn)，Leptin能夠通過STAT3(signaltransducer and activator of transcription3)通路降低FTO在下丘腦中的表達(dá)。在炎癥反應(yīng)中，STAT3能夠受到細(xì)胞因子，尤其是IL-6的激活，發(fā)揮重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)假設(shè)，LPS引起的FTO在肝臟及下丘腦中的表達(dá)差異，可能是通過STAT3的調(diào)控產(chǎn)生的。實(shí)驗(yàn)首先預(yù)測(cè)了雞FTO啟動(dòng)子上STAT3的可能結(jié)合位點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)，在FTO基因翻譯

10、起始位點(diǎn)之前3000 bp的側(cè)翼序列中有1個(gè)STAT3的可能結(jié)合位點(diǎn)。STAT3的基因及蛋白表達(dá)分析顯示，LPS注射后2h，肝臟中STAT3的基因表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，磷酸化STAT3(p-STAT3)與總STAT3的比值也顯著升高（P＜0.01）。而下丘腦中的STAT3的基因及蛋白表達(dá)都未受到影響。然而，應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）并沒有發(fā)現(xiàn)STAT3結(jié)合到肝

11、臟FTO啟動(dòng)子上。
　　在FTO的啟動(dòng)子上，還預(yù)測(cè)到9個(gè)C/EBPβ的可能結(jié)合位點(diǎn)。以往的報(bào)道發(fā)現(xiàn)，C/EBPβ能夠與STAT3互作調(diào)控基因的表達(dá)，而C/EBPβ也是炎癥反應(yīng)中重要的轉(zhuǎn)錄因子。本實(shí)驗(yàn)中并沒有發(fā)現(xiàn)LPS能夠影響肝臟及下丘腦中C/EBPβ的基因和蛋白的表達(dá)。但ChIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LPS能夠顯著增加結(jié)合在FTO啟動(dòng)子上的C/EBPβ的水平（P＜0.05）。應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)，發(fā)現(xiàn)肝臟中C/EBPβ與STAT3確實(shí)存在蛋白間

12、的互作。
　　結(jié)果提示，LPS引起FTO在肝臟中的基因表達(dá)下降可能是受到了轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ的調(diào)控。而STAT3可能通過與C/EBPβ以蛋白互作的形式參與到了FTO基因表達(dá)的調(diào)控。
　　3、LPS處理對(duì)FTO相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄本m6A修飾的影響
　　我們?cè)谙嚓P(guān)性分析中發(fā)現(xiàn)，LPS處理后2h肉雞的肝臟中，F(xiàn)TO同時(shí)與炎癥和代謝相關(guān)基因的表達(dá)顯著相關(guān)，其中包括Toll樣受體中的TLR2(P=0.01)、4(P=0.011)及T

13、LR21（P＜0.05），且FTO的表達(dá)與這三個(gè)基因的表達(dá)都呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)。檢測(cè)的細(xì)胞因子中IL-6(P＜0.01)、IL-8(P＜0.01)以及iNOS（P＜0.05）的基因表達(dá)與FTO呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)。在代謝相關(guān)的基因中，脂代謝相關(guān)的基因CPT1(P＜0.01)以及LDLR(P＜0.05)，糖異生相關(guān)的基因GR(P＜0.01)、FBP(P＜0.01)以及PCX（P＜0.05）的表達(dá)與FTO呈顯著的正相關(guān)。
　　FTO是m6A

14、的去甲基化酶。應(yīng)用m6A免疫雜交，并沒有發(fā)現(xiàn)LPS注射后肉雞肝臟中總m6A水平的變化。但是，應(yīng)用m6A免疫共沉淀技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)使用m6A特異性抗體進(jìn)行免疫沉淀，LPS處理組的免疫沉淀RNA回收率相對(duì)與對(duì)照組有上升的趨勢(shì)（P=0.064）。說明，LPS處理后肉雞肝臟RNA的m6A水平顯著升高。這一結(jié)果不同于前面使用m6A免疫雜交技術(shù)的結(jié)果，可能是由于實(shí)驗(yàn)方法的不同分辨率導(dǎo)致的。
　　進(jìn)一步，檢測(cè)了與FTO表達(dá)顯著相關(guān)的基因的m6A水

15、平。首先，對(duì)比這些基因在小鼠上的研究中是否含有m6A修飾。我們發(fā)現(xiàn)，炎癥相關(guān)基因TLR2及TLR4，脂代謝相關(guān)基因CPT1及LDLR的基因上均合有m6A修飾。同時(shí)在我們的結(jié)果中與FTO表達(dá)沒有顯著相關(guān)性的基因中，SREBP2、HMGCR基因上也含有m6A修飾。而關(guān)注的重要的轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ基因的3'UTR上也存在一個(gè)m6A修飾位點(diǎn)。根據(jù)在哺乳動(dòng)物上發(fā)現(xiàn)m6A偏向于分布在編碼開始和結(jié)束位點(diǎn)附近的規(guī)律，我們分別在雞上這些基因的編碼區(qū)起始

16、及結(jié)束位置附近設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用m6A免疫共沉淀結(jié)合qPCR技術(shù)，檢測(cè)這些區(qū)段內(nèi)m6A的相對(duì)水平是否受到了LPS的影響。
　　結(jié)果顯示，LPS處理后2h，肉雞肝臟CPT1基因編碼區(qū)開始位置附近的m6A水平相比于對(duì)照組顯著減低(P＜0.01)。而該基因編碼結(jié)束位置附近的m6A水平并沒有受到影響。C/EBPβ基因編碼區(qū)結(jié)束位置附近的m6A水平也沒有受到影響。同時(shí)檢測(cè)與FTO表達(dá)具有顯著相關(guān)性的基因，GR以及FBP1的m6A水平。結(jié)果顯示，

17、GR與FBP1基因編碼區(qū)開始位置附近的m6A水平并沒有受到LPS的影響，而FBP1基因編碼區(qū)結(jié)束位置附近的m6A水平在LPS注射組顯著低于對(duì)照組（P=0.06）。
　　結(jié)果顯示，LPS注射后2h肉雞肝臟中FTO的表達(dá)與炎癥及代謝相關(guān)的某些基因存在顯著相關(guān)性，其中CPT1基因編碼區(qū)起始位置附近的m6A水平的改變可能與肉雞肝臟脂代謝相關(guān)基因CPT1表達(dá)顯著降低有關(guān)，而FBP1基因的表達(dá)下降也有可能受到其mRNA上m6A的水平的影響。F

18、TO作為m6A的去甲基化酶，可能調(diào)控了這些基因m6A水平，進(jìn)而影響其基因的表達(dá)。
　　綜上所述:本文發(fā)現(xiàn)在LPS引起的肉雞全身性炎癥反應(yīng)中，F(xiàn)TO在肝臟及下丘腦中存在表達(dá)變化的特異性;轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ和STAT3可能受到IL-6的刺激，參與FTO的表達(dá)調(diào)控;同時(shí)FTO可能作為肝臟中炎癥及代謝反應(yīng)的連接分子，其表達(dá)變化可能會(huì)影響肝臟基因的m6A水平，其中CPT1及FBP1基因m6A水平的降低可能影響其基因的表達(dá)，進(jìn)而影響肝臟在L