鯉魚(yú)腸道sglt1的表達(dá)與抗體制備.pdf

1、以鯉魚(yú)(Cyprinus carpio)為研究對(duì)象,采用RT-PCR、SDS-PAGE電泳、ELISA等分子生物學(xué)及免疫學(xué)技術(shù),對(duì)鯉魚(yú)腸道鈉/葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)載體1(sglt1)基因的克隆、表達(dá)及Sglt1抗體制備進(jìn)行了研究?？寺×藄glt1全長(zhǎng)cDNA;表達(dá)了由sglt1基因編碼、長(zhǎng)度為92個(gè)氨基酸且具有一個(gè)抗原決定簇的多肽;以純化的多肽為抗原,通過(guò)免疫新西蘭長(zhǎng)耳兔,成功獲得了具有較高效價(jià)的Sglt1抗體。
　　 1、具有抗原決定

2、簇多肽的表達(dá)。從鯉魚(yú)腸道中克隆了sglt1基因編碼區(qū)全長(zhǎng)序列,選用pET-32a(+)Vector作為表達(dá)載體,設(shè)計(jì)限制性酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和HindⅢ,將編碼92個(gè)氨基酸、具有Sglt1抗原決定簇的核苷酸片段連接至pET-32a(+)上,經(jīng)篩選獲得陽(yáng)性重組子pET-32a(+)-sglt1(抗原決定簇片段);將陽(yáng)性重組子轉(zhuǎn)化至E.coliRosetta中,獲得重組因工程菌。通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),獲得目標(biāo)多肽。SDS-PAGE電泳分析表

3、明,目標(biāo)多肽分子量約為30kDa。
　　 2、Sglt1抗體制備。以獲得的多肽為抗原,與完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑混合,采用耳緣靜脈結(jié)合皮下注射,免疫新西蘭長(zhǎng)耳兔4次,免疫總時(shí)長(zhǎng)為38d。成功制備了鯉魚(yú)Sglt1抗體,ELISA測(cè)得效價(jià)為1:105。通過(guò)免疫組織化學(xué),驗(yàn)證了抗體的使用效果。結(jié)果表明,本研究制備的抗體可以成功應(yīng)用于鯉魚(yú)Sglt1的表達(dá)定位研究。
　　 本研究制備的Sglt1多克隆抗體是重要的研究工具,為鯉