人ndrg家族成員cDNA的克隆、表達(dá)及抗體制備.pdf

1、該文由以下幾部分組成:1.ndrg家族成員的cDNA克隆.提取人胎腦組織的總RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄制備cDNA.依據(jù)GenBank登錄的ndrg家族各成員序列分別合成了針對(duì)ndrg1、ndrg3和ndrg4-B的引物,然后進(jìn)行PCR反應(yīng)以擴(kuò)增DNA,回收和純化PCR產(chǎn)物并將其插入到Pmd18-T載體中進(jìn)行克隆后測(cè)序分析,用BLAST程序驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果.2.ndrg家族成員的原核表達(dá).將測(cè)序正確的片段插入到pRSET-A、pGEX-4T-1、pP

2、ROEX-HTb等表達(dá)載體中,分別用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),發(fā)現(xiàn)pPROEX-HTb- ndrg1所編碼的NDRG1蛋白有高效可溶性表達(dá).3.NDRG1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析.融合表達(dá)的6His-NDRG1蛋白經(jīng)Ni-NTA偶聯(lián)的瓊脂糖珠純化后,進(jìn)行圓二色性分析.發(fā)現(xiàn)在該分子中,幾種蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)所占比列如下:α螺旋;23.6﹪,β片層:18.6﹪,轉(zhuǎn)角:25.7﹪,無(wú)規(guī)則卷曲:32.0﹪這與計(jì)算機(jī)程序預(yù)測(cè)的結(jié)果相近.4.抗人NDRG家族的多克隆

3、抗體制備.用可溶性的6His-NDRG1蛋白免疫家兔獲得了高效價(jià)的兔抗人NDRG1多克隆抗血清,利用固定于硝酸纖維素膜上的NDRG1抗原進(jìn)行親和吸附,以純化抗血清,提高了NDRG1多克隆抗體的特異性,并用此純化的抗體進(jìn)行了免疫組化和Western檢測(cè).由于NDRG家族各成員間氨基酸組成有很高的同源性,此抗體在識(shí)別NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4時(shí)存在交叉,表明已獲得抗人NDRG家族的多克隆抗體.5.抗人NDRG家族寡肽的多