Neurocan基因蛋白表達及其抗體制備與檢測的實驗研究.pdf

1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central Nervous System，CNS）損傷后的修復受多種因素影響，其中抑制因子釋放和膠質瘢痕形成為主要原因之一。目前已經(jīng)分離和鑒定的軸突生長抑制因子有：Nogo-A、髓磷脂相關糖蛋白（myelin-associated glycoprotein，MAG）、少突膠質細胞髓磷脂糖蛋白（oligodendrocyte-myelin glycoprotein，OMgp）等。研究發(fā)現(xiàn)，Nogo-A、MAG、OMgp發(fā)

2、生作用時都有LINGO-1蛋白的參與。在膠質瘢痕對軸突再生的影響中，硫酸軟骨素蛋白多糖（Chondroitin Sulphate Proteoglycans，GSPGs）是目前已知的一個阻礙軸突再生的重要因子，特異存在于CNS，而Neurocan則為GSPGs的核心蛋白組分之一，并且顯示了對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞神經(jīng)突生長的抑制作用。腱糖蛋白-R（tenascin-R，TN-R）是瘢痕組織中所含有的另一種有軸突生長抑制作用的細胞外基質成分。把

3、LINGO-1、Neurocan和TN-R設計成三基因聯(lián)合DNA疫苗，將會使疫苗在體內發(fā)揮作用后、產(chǎn)生抗體并與相關抑制因子結合，以消除抑制作用、促進神經(jīng)再生。本研究則主要是進行Neurocan基因的蛋白表達及其抗體制備，并且對其進行檢測，探討DNA疫苗制作前期技術方案的可行性，為后續(xù)CNS損傷修復實驗工作奠定基礎。 目的： 制備Neurocan蛋白，用此蛋白免疫動物制備抗血清，并對抗血清的效價和特異性進行檢測，最終使待參

4、與DNA疫苗構成的Neurocan蛋白所產(chǎn)生抗體能與腦內創(chuàng)傷區(qū)的相應抑制性蛋白抗原結合。 方法： 從基因庫調出Neurocan的基因序列，合成Neurocan基因，序列起始端加His標簽，兩端設計酶切位點。構建原核表達質粒PET30a（+）-Neurocan，對合成的Neurocan基因進行測序鑒定。將質粒轉化到大腸桿菌BL21感受態(tài)，挑菌培養(yǎng)，使用OMEGA公司質粒提取試劑盒（E.Z.N.A. TM Plasmid M

5、ini KitⅡ50）提取質粒。對質粒進行酶切鑒定和PCR鑒定，鑒定正確后，對菌株進行異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside，IPTG）誘導表達，采用不同的誘導時間和IPTG濃度，確定最佳表達條件。對目的蛋白進行純化，使用PIERCE公司的BCATM Protein Assay Kit試劑盒測定蛋白濃度。對目的蛋白進行SDS-PAGE檢測，觀察目的蛋白的純度和分子量大??；對

6、目的蛋白進行Western blot鑒定，一抗使用小鼠抗His抗體，二抗使用馬抗小鼠-AP抗體，顯色底物為NBT/BCIP。Neurocan蛋白免疫兔制備免疫血清，分4次免疫，皮內注射。Elisa法檢測抗血清效價，以Neurocan蛋白包被酶標板，兔免疫前血清為陰性對照，二抗為山羊抗兔-HRP，底物顯色后酶標儀檢測；Western blot檢測抗血清特異性，以免疫血清為一抗，山羊抗兔-AP為二抗，NBT/BCIP顯色。 結果：

7、 合成的Neurocan基因經(jīng)測序鑒定，顯示序列正確，且開放讀碼框正確。Neurocan基因經(jīng)連接、轉化、誘導表達后，測得蛋白濃度為0.673ug/ul。目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE鑒定，目的條帶分子量大小約為55kD；經(jīng)Western blot鑒定，在55kD處有特異性條帶，與SDS-PAGE鑒定結果一致，目的蛋白能與His抗體特異性結合。制備的抗血清經(jīng)Elisa法檢測，效價達到1：100萬；經(jīng)Western blot檢測，在55

8、kD處的目的條帶明顯。 討論： 本研究中，首先對合成的Neurocan基因進行了測序鑒定，顯示其序列正確，且開放讀碼框和酶切位點與本課題設計的一致。接著將包含Neurocan基因的質粒PET30a（+）-Neurocan轉化到大腸桿菌BL21，進行Neurocan蛋白的原核表達，對表達出的蛋白進行SDS-PAGE鑒定，其分子量大小與通過堿基數(shù)計算出來的大小一致。進一步對其進行Western blot鑒定，因為本實驗在Ne

9、urocan基因的起始端設計了His標簽，故一抗用His抗體，結果顯示目的蛋白能與His抗體特異性結合，說明該目的蛋白是Neurocan基因的表達產(chǎn)物，而Neurocan基因經(jīng)過測序鑒定正確，提示Neurocan蛋白的原核表達成功。用此蛋白免疫兔制備的抗血清，經(jīng)Elisa檢測，效價達到1：100萬；進一步用Western blot檢測，都證明特異性良好，所制備的多克隆抗體能與Neurocan蛋白特異性結合。因此提示，Neurocan蛋白