PKCβ-p66Shc介導(dǎo)高水平尿素引起人臍靜脈內(nèi)皮細胞ROS和炎癥的產(chǎn)生.pdf

1、心血管病（cardiovascular disease，CVDs）是終末期腎臟疾病(End Stage Renal Disease，ESRD)患者最常見的并發(fā)癥以及最主要的死亡原因，其致死率比其它并發(fā)癥高10～20倍[1]。而ESRD并發(fā)CVDs中又以動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）多見[2]。ESRD患者存在多種導(dǎo)致心血管疾病的危險因素，如吸煙、高血壓、糖尿病、肥胖和血脂異常等，但這些傳統(tǒng)的危險因素并不能完全解釋在

2、 ESRD患者并發(fā)CVDs特別是AS的高發(fā)性和較高的死亡率[3-6]，因此，研究AS的病理改變機制對于提高ESRD患者的生存和生活質(zhì)量十分重要。
　　氧化應(yīng)激作為重要危險因素在CVDs特別是AS的發(fā)病機制中具有重要作用。血管壁ROS的大量產(chǎn)生不僅可導(dǎo)致一氧化氮（nitric oxide，NO）生物利用度降低而引起內(nèi)皮功能障礙，并且可損傷血管壁結(jié)構(gòu)而促進AS的形成[7,8]。炎癥（inflammatory）在AS的形成中的重要作用也

3、不容忽視[9,10]。炎癥早期可募集免疫細胞至動脈，晚期可激活動脈壁的 T細胞產(chǎn)生并分泌炎性細胞因子，促進炎癥的發(fā)生發(fā)展[11]。有研究表明，高水平尿素可誘發(fā)脂肪細胞的氧化應(yīng)激和功能障礙，引發(fā)胰島素抵抗[12]。ESRD患者體內(nèi)的血尿素水平會隨著腎功能進行性下降而不斷增高；高尿素水平是否為誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）大量產(chǎn)生以及促進炎癥發(fā)生的重要病理因素，其機制如何？目前尚不清楚。<

4、br>　　銜接蛋白p66Shc是由原癌基因ShcA編碼、廣泛表達于哺乳動物細胞內(nèi)有調(diào)節(jié)線粒體功能的蛋白，介導(dǎo)了包括高血糖、同型半胱氨酸等多種病理因素所誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能失常[13]。而PKCβ是介導(dǎo)p66Shc蛋白磷酸化及其線粒體轉(zhuǎn)位的關(guān)鍵蛋白[14]，PKCβ/p66Shc/mCyt.C復(fù)合物的形成在PKCβ介導(dǎo)的細胞氧化損傷中起到關(guān)鍵作用[15]。我們在前期工作中發(fā)現(xiàn)高尿素可誘導(dǎo)p66Shc磷酸化水平的增高，那么，高尿素是否通過PK

5、Cβ/p66Shc通路誘導(dǎo)ROS的大量產(chǎn)生和炎癥的發(fā)生？因此，本研究擬采用體外實驗驗證以上假設(shè)。
　　目的：
　　探討PKCβ/p66Shc通路在高水平尿素引起人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）、ROS和炎癥產(chǎn)生中的作用。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)HUVECs，分為正常對照組、甘露醇組、尿素組和尿素+PKCβ抑制劑(LY333531)組。

6、采用CCK-8法檢測高水平尿素對HUVECs活性的影響，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)的改變；DCFH-DA法檢測細胞內(nèi)ROS含量；免疫熒光技術(shù)觀察細胞內(nèi)p-p66Shc、TNFα和ICAM-1的表達；Western blot檢測細胞中p66Shc、p-p66Shc、PKCβ、p-PKCβ、TNFα、ICAM-1、iNOS和eNOS的表達水平。
　　結(jié)果：
　　1.25mmol/L尿素明顯抑制HUVECs活力，引起細胞排列紊亂，細胞

7、間隙增大，鋪路石樣排列結(jié)構(gòu)受到破壞等形態(tài)學改變。
　　2.與對照組相比，25 mmol/L尿素引起細胞內(nèi)ROS水平明顯升高，在6 h達到峰值（P＜0.05）；加入PKCβ抑制劑LY333531后ROS水平明顯降低（P＜0.05）。
　　3.25 mmol/L尿素負荷6 h后可見細胞胞漿內(nèi)p-p66Shc、TNFα和ICAM-1熒光強度明顯增強；與此同時，尿素可誘導(dǎo)p-PKCβ、p-p66Shc、TNFα、ICAM-1和iNO

8、S蛋白的表達呈時間依賴性增加，其中p-p66Shc6 h組與對照組相比，升高了約76%（P＜0.01），24 h時升高了約2倍（P＜0.01）；p-PKCβ與對照組相比，24 h時升高了約64%（P＜0.05）。TNFα與對照組相比，6 h增加了約40%，24 h增加了約一倍（P＜0.05）；ICAM-1在6 h增加了約80%，24 h增加了約2倍（P＜0.05）；iNOS24 h升高了約1倍（P＜0.05）；eNOS與對照組相比，12

9、 h下降了約34%（圖7B，P＜0.05），24 h下降了約56%（P＜0.01）
　　4.加入LY333531后p-p66Shc、TNFα和ICAM-1熒光強度降低，同時，Western blot結(jié)果顯示，p-p66Shc、TNFα、ICAM-1蛋白表達下調(diào)，p-p66Shc蛋白的表達水平與對照組相比，降低了約40%（P＜0.05）；與6 h組相比，TNFα減少了約61%（P＜0.05）；ICAM-1減少了約94%（P＜0.01