水蛭素調(diào)節(jié)MAPKs通路促進大鼠缺血皮瓣血管生成及抗血管內(nèi)皮細胞凋亡的研究.pdf

1、第一章:水蛭素通過調(diào)節(jié)p38MAPK與ERK通路間的交匯作用促進大鼠缺血皮瓣血管生成
　　背景：隨意皮瓣在整形外科或創(chuàng)傷外科常常被用于修復創(chuàng)傷、功能重建或改善外觀。當其長寬比例過大，皮瓣遠端將會有可能發(fā)生血運循環(huán)障礙，最終可導致皮瓣部分壞死。前期研究發(fā)現(xiàn)局部注射水蛭素治療能通過有效的促進缺血皮瓣組織中的微血管生成，從而增加皮瓣最終成活面積。但水蛭素是如何促進皮瓣微血管生成的相關分子機制卻未能進一步闡明。
　　目的：在這部分研

2、究中，將探討水蛭素是否同過調(diào)解血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）和血小板反應蛋白1（TSP-1）與內(nèi)皮抑素（Endostatin）之間表達的平衡促進皮瓣微循環(huán)的重建。此外，同時研究水蛭素促皮瓣微循環(huán)重建是否與調(diào)控絲裂原激活蛋白激酶類（MAPKs）通路激活有關。
　　方法：在每只SD大鼠的背部中線兩側(cè)分別構(gòu)建1個大小為7.5cm×1.5cm的缺血皮瓣模型。將皮瓣隨機分為水蛭素組和對照組，水蛭素組皮瓣在皮下注射2 ATU水蛭素，而對照組

3、則注射等量的生理鹽水。治療的時間為在術(shù)后即刻以及在術(shù)后第1、2和3天。術(shù)后第6天拍攝皮瓣的影像并計算皮瓣的成活面積和壞死面積。分別在術(shù)后0、1、2、4和6天提取皮瓣組織的總蛋白分進行免疫印跡分析。同時還檢測了術(shù)后第4天和地6天皮瓣組織中的血管密度值（MVD）。
　　結(jié)果：術(shù)后的第6天，水蛭素組皮瓣成活率(90±5.8％)明顯高于對照組(62±7.1%)，差異有統(tǒng)計學意義；組織學觀察發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后第4天，對照組皮瓣的表皮層與真皮層開始

4、出現(xiàn)部分壞死，皮瓣組織較少觀察到微血管。而水蛭素治療組皮瓣可觀察到早期的血管新生現(xiàn)象且組織壞死明顯少于對照組。術(shù)后第4天，水蛭素組血管密度值明顯多于對照組；在術(shù)后第6天，水蛭素組血管密值度為35.90±6.76 per field，而對照組因為大面積的壞死，未能觀察到成功染色的血管。皮瓣在形成后凝血酶的表達在術(shù)后的6天里持續(xù)增高，水蛭素能減少術(shù)后第1、2天凝血酶的表達量。在兩組皮瓣中VEGF術(shù)后均呈現(xiàn)表達升高，但水蛭素組的VEGF表達明

5、顯高于對照組。在水蛭素組，endostatin的表達在術(shù)后第1、2和4天低于對照組。在水蛭素治療組皮瓣中，TSP-1的表達在術(shù)后1至6天均有明顯的降低。局部應用水蛭素能減少缺血皮瓣組織中p38 MAPK的磷酸化水平，提升的ERK1/2磷酸化水平，凝血酶可逆轉(zhuǎn)水蛭素對這兩種蛋白激酶的反向調(diào)控作用。抑制皮瓣中p38 MAPK的磷酸化可減少凝血酶誘導的TSP-1表達，但對endostatin的表達無影響。實驗發(fā)現(xiàn)，當注射了p38 MAPK抑制

6、劑3h后，可觀察到皮瓣組織ERK1/2激活水平明顯升高。但在水蛭素誘導的ERK1/2活性被ERK1/2抑制劑抑制后，p38 MAPK的磷酸化水平并未受到影響。這一結(jié)果提示在皮瓣缺血條件下，存在著一個p38 MAPK到 ERK1/2的單向通路交匯作用。PAR1抑制劑注射后能明顯減少p38 MAPK的磷酸化，而增加ERK1/2磷酸化的水平(p<0.01)。這一結(jié)果與水蛭素治療后觀測到的相似。在PAR1被拮抗的情況下，水蛭素并不能進一步降低p

7、38 MAPK的磷酸化，但仍然可以升高ERK1/2的磷酸化水平。這一實驗說明，ERK1/2的激活是部分來自對p38 MAPK的抑制，而一部分可能與水蛭素其他作用有關。
　　結(jié)論：研究發(fā)現(xiàn)，水蛭素的促血管生成作用不僅是通過促進VEGF的生成，還可能包括減少血管生成抑制因子TSP-1和endostatin的釋放。p38 MAPK和ERK1/2之間的通路交匯作用存在于缺血皮瓣組織中，水蛭素通過拮抗凝血酶/PAR1相關通路來調(diào)控該交匯作用

8、，進而調(diào)控血管生成或抑制因子的表達，影響皮瓣組織血管生成的過程。
　　第二章：缺氧條件下水蛭素對皮瓣血管內(nèi)皮細胞保護作用相關機制研究
　　背景：在前期研究中，將水蛭素直接應用于活體實驗，發(fā)現(xiàn)能有效的改善血運障礙皮瓣的血液循環(huán)，并能促進皮瓣組織內(nèi)血管增殖，但前期的研究未能進一步的深入探討水蛭素對血管內(nèi)皮細胞(VECs)的影響。
　　目的：研究水蛭素對缺氧或凝血酶誘導大鼠血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響。
　　方法：應用CD3

9、1免疫熒光定位血管內(nèi)皮細胞，在此基礎上應用Tunel法檢測細胞的凋亡，以此計算皮瓣中血管內(nèi)皮細胞的凋亡率。從SD大鼠主動脈中分離并培養(yǎng)出大鼠血管內(nèi)皮細胞。在細胞培養(yǎng)出來后，應用CD31免疫熒光和流式細胞學鑒定血管內(nèi)皮細胞。實驗將細胞分為正常組對照組（Nor組）、缺氧對照組（Cont組）、凝血酶組（2 U/ml凝血酶，Tho組）、水蛭素組（2ATU/ml水蛭素，Hir組）、低濃度水蛭素凝血酶組（1ATU/ml水蛭素+2/ml U凝血酶，L

10、ow-T+H組）和高濃度水蛭素凝血酶組（2ATU/ml水蛭素+2/ml U，凝血酶High-H+T組）。在細胞經(jīng)受缺氧刺激后6小時，將細胞總蛋白提出，并檢測Bim、ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化水平。同時，應用Tunel分析各組細胞的凋亡率。
　　結(jié)果：在缺血皮瓣組織中，對照組血管內(nèi)皮細胞凋亡率為87.24±8.34%，水蛭素組凋亡率為36.44±9.57%，兩組經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學意義。當培養(yǎng)基中含有2 U/ml凝血酶

11、時，細胞在缺氧條件下的凋亡率顯著升高(p<0.01)。應用水蛭素對抗凝血酶后，可降低凝血酶誘導的細胞凋亡。缺氧可造成血管內(nèi)皮細胞的p38 MAPK磷酸化水平升高，若這種情況下培養(yǎng)基中還存在有凝血酶，那么凝血酶可使得血管內(nèi)皮細胞內(nèi)p38 MAPK磷酸化水平進一步升高。水蛭素可抑制凝血酶誘導的細胞內(nèi)p38 MAPK磷酸化。在20μM的SB203580抑制p38 MAPK磷酸化的情況下添加2 U/ml凝血酶不能使得細胞凋亡增加。還發(fā)現(xiàn)，應用S

12、B203580抑制p38 MAPK磷酸化后，ERK1/2的磷酸化水平與對照組（Cont組）相比得到提高，說明可能存在p38 MAPK和ERK1/2通路間交匯。水蛭素可降低凝血酶誘導的p38 MAPK磷酸化并促進ERK1/2的激活水平。同時，觀察到在Low-T+H組Bim的磷酸化水平明顯低于凝血酶組（Tho組）。
　　結(jié)論：缺氧狀態(tài)下凝血酶可進一步的刺激p38 MAPK磷酸化和抑制ERK1/2的磷酸化，增加大鼠血管內(nèi)皮細胞凋亡。水蛭