穿山龍水溶性總皂苷對(duì)大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞株RSC-364NF-κB調(diào)控作用的研究.pdf

1、研究背景:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種常見多發(fā)的自身免疫性疾病,其主要病理特征以慢性關(guān)節(jié)炎癥為主,有滑膜細(xì)胞增生,血管翳形成,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)并侵犯周圍滑膜組織等,起病反復(fù),給患者帶來(lái)很大痛苦,對(duì)社會(huì)和家庭也是巨大的負(fù)擔(dān)。RA的發(fā)病機(jī)制還不完全清楚,已有研究表明:炎性細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α在病變部位的持續(xù)作用對(duì)RA的維持和發(fā)展起重要作用,而炎性細(xì)胞因子的釋放是受核轉(zhuǎn)錄因子NF-κ

2、B控制,NF-κB作為一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子在RA發(fā)病中的作用主要有兩個(gè)途徑:一是核轉(zhuǎn)錄因子κB活化后可增強(qiáng)炎性介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄水平,同時(shí)這些炎癥介質(zhì)又可以反過(guò)來(lái)激活NF-κB的表達(dá),兩者構(gòu)成正反饋機(jī)制導(dǎo)致類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)的進(jìn)行。二是可以阻斷滑膜細(xì)胞的凋亡,導(dǎo)致滑膜細(xì)胞增生。核轉(zhuǎn)錄因子κB能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡抑制蛋白的表達(dá),對(duì)腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞的凋亡有拮抗作用。因此,核轉(zhuǎn)錄因子κB是治療RA具有吸引力的靶點(diǎn)。
　　

3、 穿山龍水溶性總皂苷(water-solubility nipponica saponin)是薯蕷科植物穿山龍薯蕷(Rhizoma dioscreae,RDN)的干燥根莖穿山龍的有效治療成分,具有免疫抑制作用。本課題組前期工作表明,穿山龍總皂苷對(duì)RA動(dòng)物模型有較好的治療作用。
　　 目的:本研究以大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞株RSC-364為對(duì)象,用IL-17、TNF-α誘導(dǎo)制備RA的細(xì)胞模型,通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞中的NF-κBp65蛋白、Iκ

4、B-α蛋白和NF-κBp65 mRNA、IκB-αmRNA的表達(dá),探討穿山龍水溶性總皂苷對(duì)RA的治療作用及機(jī)制,為臨床應(yīng)用穿山龍治療RA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.培養(yǎng)大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞株RSC-364,應(yīng)用IL-17、TNF-α作為刺激物誘導(dǎo)RA細(xì)胞模型。
　　 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RSC-364細(xì)胞(2×104/ml）,每孔1000μl加入六孔板培養(yǎng)24h,分別在孔中加入白介素-17(10μg/L)+

5、腫瘤壞死因子-α(10μg/L),于37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí),制備細(xì)胞模型。
　　 2.將10mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L穿山龍水溶性總皂苷溶液,作用于RSC-364細(xì)胞,孵育12h、24h、36h、48h后加MTT,4h后加DMSO,應(yīng)用全自動(dòng)酶聯(lián)儀測(cè)定細(xì)胞的OD值(光密度),通過(guò)OD值反應(yīng)細(xì)胞的存活率,比較不同濃度的穿山龍水溶性總皂苷作用不同時(shí)間對(duì)RSC-364細(xì)胞存活率的

6、影響,以篩選出最佳藥物濃度和作用時(shí)間。
　　 3.大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞株RSC-364接種于六孔板,不同藥物組分為4組:正常組、模型組、雷公藤甲素組、穿山龍水溶性總皂苷組。穿山龍水溶性總皂苷不同濃度組分為正常組、模型組、穿山龍水溶性總皂苷10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L組。
　　 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RSC-364細(xì)胞(2×104/ml),每孔1000μl加入六孔板培養(yǎng)24h,藥物組分別加入雷公藤甲素、穿山龍水溶

7、性總皂苷培養(yǎng)1h后加入TNF-α(10μg/L)+IL-17(10μg/L),模型組直接加入刺激物,正常組不作處理。將細(xì)胞置于37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí),測(cè)定NF-κBp65和IκB-α表達(dá)情況。同樣培育方法檢測(cè)穿山龍水溶性總皂苷不同濃度組。
　　 4.分別提取各組細(xì)胞蛋白,進(jìn)行蛋白定量計(jì)算上樣體積,采用western blot的方法檢測(cè)各組NF-κBp65蛋白和IκB-α蛋白的表達(dá)。
　　 5.提取各組細(xì)胞mRN

8、A,逆轉(zhuǎn)錄cDNA,應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組NF-κBp65 mRNA和IκB-αmRNA的表達(dá)。
　　 6應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,判斷結(jié)果是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±S)表示,組間差異用單因素方差分析,兩兩比較用q檢驗(yàn),以α=0.05作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果:
　　 1.不同濃度穿山龍水溶性總皂苷對(duì)細(xì)胞存活率的影響。
　　 分別將濃度為10 mg/

9、L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L的穿山龍水溶性總皂苷作用于RSC-364細(xì)胞,用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率,各濃度組作用于細(xì)胞12h、24h時(shí),細(xì)胞存活率較高,作用36h和48h時(shí),所有濃度組細(xì)胞存活率均明顯降低,較對(duì)照組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。藥物作用于細(xì)胞24小時(shí)時(shí)10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L濃度組OD值同對(duì)照組比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)無(wú)明顯的細(xì)胞毒性.40 mg

10、/L、50 mg/L濃度使細(xì)胞存活率明顯下降,表現(xiàn)出明顯細(xì)胞毒性,OD值同對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 2.穿山龍水溶性總皂苷對(duì)細(xì)胞NF-κBp65蛋白表達(dá)的影響
　　 用Western blot方法檢測(cè)各組NF-κBp65蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示:正常組最低,模型組NF-κBp65蛋白表達(dá)量最高,而雷公藤甲素組、穿山龍水溶性總皂苷組NF-κBp65蛋白表達(dá)較模型組顯著降低(P＜0.05),兩藥物組之間差別

11、無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。穿山龍水溶性總皂苷三個(gè)不同濃度組均對(duì)NF-κB表達(dá)呈現(xiàn)抑制作用,不同濃度間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.穿山龍水溶性總皂苷對(duì)細(xì)胞IκB-α蛋白表達(dá)的影響
　　 用Western blot方法檢測(cè)各組IκB-α蛋白的表達(dá)。各組相比較:正常組最高,模型組IκB-α蛋白表達(dá)量最低,而雷公藤甲素組、穿山龍水溶性總皂苷組相較于模型組IκB-α蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05),兩藥物組之

12、間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。穿山龍水溶性總皂苷三個(gè)不同濃度組均提升IκB-α蛋白表達(dá)量并呈現(xiàn)劑量依賴性(P＜0.05)。
　　 4.穿山龍水溶性總皂苷對(duì)細(xì)胞NF-κBp65 mRNA表達(dá)的影響
　　 用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組NF-κBp65 mRNA的表達(dá)。正常組最低,模型組最高,與模型組相比,雷公藤甲素組、穿山龍水溶性總皂苷組NF-κBp65 mRNA表達(dá)顯著降低,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),兩藥物組之間差

13、別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。同模型組相比,穿山龍水溶性總皂苷三個(gè)不同濃度組均對(duì)NF-κBp65 mRNA表達(dá)呈現(xiàn)濃度依賴性抑制作用(P＜0.05)。
　　 5穿山龍水溶性總皂苷對(duì)細(xì)胞IκB-αmRNA表達(dá)的影響
　　 用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組IκB-αmRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示:正常組最高,模型組IκB-αmRNA表達(dá)量最低,雷公藤甲素組、穿山龍水溶性總皂苷組IκB-αmRNA表達(dá)較模型組顯著升高,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

14、P＜0.05),兩藥物組之間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。穿山龍水溶性總皂苷三個(gè)不同濃度組均提升IκB-αmRNA表達(dá)并呈現(xiàn)劑量依賴性(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.不同濃度的穿山龍水溶性總皂苷對(duì)RSC-364細(xì)胞存活率有不同影響:30mg/L濃度及其以下濃度對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用,而40mg/L濃度及其以上對(duì)細(xì)胞具有明顯毒性。
　　 2.RSC-364細(xì)胞模型中,模型組細(xì)胞NF-κBp65 mRN