慢性乙型肝炎患者肝組織內(nèi)HBVX基因啟動(dòng)子甲基化與臨床關(guān)系的初步研究.pdf

1、目的：檢測(cè)慢性乙型病毒性肝炎患者肝組織中HBV X基因啟動(dòng)子甲基化程度，并對(duì)其甲基化水平與臨床關(guān)系進(jìn)行初步探討。
　　 方法：收集2009年7月-2010年3月在天津市傳染病醫(yī)院住院的慢性乙型肝炎患者肝組織標(biāo)本和血清標(biāo)本各45例，其中HBeAg(+)30例，HBeAg(-)15例，年齡16-65歲。所有病例均符合2005年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、感染病學(xué)分會(huì)聯(lián)合制訂的《慢性乙型肝炎防治指南》中的慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。檢測(cè)所有患者血

2、清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transaminase，ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)及總膽紅素(total bilirubin，TBiL)水平。應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法定量檢測(cè)血清中乙型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis Bs antigen，HBsAg)、乙型肝炎病毒e抗原(Hepatitis B e antigen，HBeAg)水平。應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)肝組織內(nèi)

3、HBsAg、乙型肝炎病毒核心抗原(Hepatitis Bcore antigen，HBcAg)的表達(dá)。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)方法檢測(cè)血清HBV DNA水平。利用MethPrimer軟件分析預(yù)測(cè)HBV DNA CpG島，同時(shí)采用高分辨率熔解技術(shù)(High Resolution Melting，HRM)檢測(cè)HBV X基因啟動(dòng)子CpG島甲基化水平。
　　 結(jié)果：①45例肝穿標(biāo)本免疫組化結(jié)果：HBsAg(+)：35

4、例，HBsAg(-)：10例；HBcAg(+)：23例，HBcAg(-)：22例。②45例肝組織標(biāo)本中，共檢測(cè)到HBV發(fā)生甲基化21例(21/45，46.7％)，其中血清HBeAg(+)：10例(10/21，47.6％)，免疫組化HBsAg(+)：11例(11/21，52.4％)，HBcAg(+)：7例(7/21，33.3％)；HBV未發(fā)生甲基化24例(24/45，53.3％)，其中血清HBeAg(+)：20例(20/24，83.3％)

5、，免疫組化HBsAg(+)：24例(24/24，100％)，HBcAg(+)：16例(16/24，66.7％)。分別比較甲基化組和未甲基化組患者血清中HBeAg、肝組織中HBsAg、HBcAg的陽(yáng)性表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。③甲基化組與未甲基化組慢性乙型肝炎患者，在性別構(gòu)成、年齡、血清生化學(xué)指標(biāo)ALT、AST、TBiL以及病毒學(xué)指標(biāo)HBV DNA、HBsAg、HBeAg水平等方面差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。④21

6、例發(fā)生甲基化的肝組織標(biāo)本中，血清HBeAg(-)組甲基化水平(61.45±18.27)與HBeAg(+)組(34.10±16.03)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.631，P<0.01)；HBeAg(-)組血清HBV DNA水平(4.32±1.57)與HBeAg(+)組(7.03±1.57)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t'=5.100，P<0.01)。⑤21例發(fā)生甲基化的患者中，血清HBV DNA水平與HBV DNA甲基化水平呈負(fù)相關(guān)(r

7、=-0.832，P<0.01)，HBeAg水平與HBV DNA甲基化水平呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.657，P<0.05)；HBV DNA甲基化水平與患者年齡呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.706，P<0.05)，而與血清HBsAg、ALT、AST、TBiL水平均無(wú)相關(guān)性(rs值分別為0.165、0.432、0.24、0.291，P>0.05)。
　　 結(jié)論：⑴HBV DNA CpG島2存在于HBV C基因型(AB540585)第1228-16

8、65位堿基序列中，存在于HBV B基因型(AB540582)第1246-1672位堿基序列中，島2與HBV增強(qiáng)子I、X基因啟動(dòng)子區(qū)域重疊，緊鄰增強(qiáng)子Ⅱ和C基因啟動(dòng)子。⑵甲基化組慢性乙型肝炎患者血清HBeAg、肝組織HBsAg和HBcAg的陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于未甲基化組。發(fā)生甲基化的慢性乙型肝炎患者中，HBeAg陽(yáng)性組血清甲基化水平低于HBeAg陰性組，HBV DNA水平高于HBeAg陰性組。血清HBV DNA、HBeAg水平與肝組織內(nèi)HB

9、V X基因啟動(dòng)子CpG島甲基化水平呈負(fù)相關(guān)。提示HBV X基因啟動(dòng)子CpG島甲基化可能抑制了血清中HBeAg的表達(dá)和肝組織內(nèi)HBsAg和HBcAg的表達(dá)以及HBV DNA的復(fù)制。⑶甲基化組與未甲基化組慢性乙型肝炎患者在性別、年齡、血清生化學(xué)指標(biāo)ALT、AST、TBiL、血清病毒學(xué)指標(biāo)HBV DNA、HBsAg、HBeAg水平方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是，發(fā)生甲基化的患者中，甲基化水平與患者年齡呈負(fù)相關(guān)，隨著年齡的增長(zhǎng)，甲基化水平有降