乙型肝炎病毒X蛋白促p16INK4A基因啟動(dòng)子甲基化及其機(jī)制的研究.pdf

1、肝細(xì)胞性肝癌(HCC)是威脅全世界人民尤其是中國人民身體健康的最常見的惡性腫瘤之一。研究發(fā)現(xiàn),HCC的發(fā)生與黃曲霉素B1的污染、酒精性肝硬化、某些遺傳性肝臟疾病、特別是乙型或丙型肝炎病毒(HBV或HCV)的感染密切相關(guān)。HBV感染的人群中,HCC的發(fā)生率比普通人群高200倍至300倍左右,我國HCC病人HBV標(biāo)志物陽性率更高達(dá)90％左右。HCC的發(fā)生是一個(gè)多因子、多步驟的過程,但其具體機(jī)制仍不清楚。
　　有研究表明,抑癌基因如GS

2、TP、SOCS-1、APC、E-cadherin、RAR-β、p14、p15、p16和p73啟動(dòng)子區(qū)高甲基化普遍存在于肝癌和其它人類惡性腫瘤中。HBV的感染能增加抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化而使其表達(dá)下調(diào),該機(jī)制可能是HBV相關(guān)HCC中病毒致癌的一個(gè)重要途徑。HCC中普遍存在p16INK4A啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化,而且HBV感染能顯著增加肝組織p16INK4A啟動(dòng)子區(qū)的甲基化頻率,從而使p16蛋白低表達(dá)或不表達(dá),在HCC形成早期起了重要作用。本

3、課題組前期研究結(jié)果提示,在組織學(xué)水平,HBV的X蛋白(HBx)與p16INK4A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化相關(guān),但其中的機(jī)制尚不清楚。
　　本研究一方面選取了大量HBV相關(guān)HCC部分肝切除標(biāo)本作為研究對象,同時(shí)輔以部分HBV陰性標(biāo)本作為對照。通過對HCC的癌組織和相應(yīng)的癌旁組織在mRNA水平和蛋白水平進(jìn)行檢測,對組織水平HBx與p16INK4A的啟動(dòng)子高甲基化相關(guān)性進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn),明確HBx與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)和去甲基化酶的表達(dá)

4、是否相關(guān),DNMTs和去甲基化酶的表達(dá)是否與p161NK4A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化相關(guān)。另一方面在體外細(xì)胞水平通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBx質(zhì)粒至肝癌細(xì)胞研究HBx促進(jìn)p16INK4A啟動(dòng)子高甲基化的機(jī)制,明確DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1,DNMT3A,DNMT3B和去甲基化酶MBD2在HBx促進(jìn)p16INK4A啟動(dòng)子高甲基化過程中各自的作用,為HBV相關(guān)HCC的形成機(jī)制提供新的研究方向。
　　第一部分：乙型肝炎病毒X蛋白與p16I

5、NK4A啟動(dòng)子甲基化及甲基轉(zhuǎn)移酶的相關(guān)性的體內(nèi)研究
　　目的:通過對HBV相關(guān)HCC的癌組織和相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本中HBx與p16INK4A啟動(dòng)子高甲基化及甲基轉(zhuǎn)移酶的相關(guān)性研究,明確HBx與p16INK4A啟動(dòng)子甲基化和DNMTs以及去甲基化酶的表達(dá)是否相關(guān)。
　　方法:收集88例HBV相關(guān)HCC部分肝切除標(biāo)本癌組織和癌旁組織進(jìn)行分析,并收集部分HBV陰性標(biāo)本作為對照。p16INK4A啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的檢測采用甲基化特異性聚

6、合酶鏈反應(yīng)(MSP);熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測HBx,DNMT1,DNMT3A,DNMT3B,去甲基化酶MBD2的表達(dá)和肝組織內(nèi)HBVDNA的含量;HBV基因型采用巢式PCR和限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)進(jìn)行檢測;Westernblot和免疫組化EnVision二步法檢測組織HBx,DNMT1,DNMT3A和p16蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:在HBV相關(guān)HCC病例的癌旁組織中,HBx的高表達(dá)與p16INK4A啟動(dòng)子高甲基化相關(guān);無論

7、是在mRNA水平還是蛋白水平,HBx的表達(dá)與DNMT1和DNMT3A的表達(dá)均呈正相關(guān);而且HBx,DNMT1和DNMT3A的表達(dá)與p16蛋白的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)。在HBV相關(guān)HCC病例的癌組織中,HBx的表達(dá)與DNMT1和DNMT3A的表達(dá)在mRNA水平和蛋白水平均呈正相關(guān);但HBx的高表達(dá)與p16INK4A啟動(dòng)子高甲基化和p16蛋白的表達(dá)均不相關(guān)。p16INK4A啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與患者年齡,性別,血清中AFP,CEA,CA199水平無關(guān),

8、與血清AST,ALT水平,病毒基因型,HBV-DNA水平,腫瘤分化程度,癌旁組織Scheuer評分也無相關(guān)性。
　　結(jié)論:p16INK4A啟動(dòng)子甲基化在肝癌中普遍存在,其表達(dá)量與HBx蛋白呈負(fù)相關(guān)。在HBV相關(guān)HCC形成的早期階段,HBx可能通過上調(diào)甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1和DNMT3A促進(jìn)p16INK4A啟動(dòng)子甲基化從而使其表達(dá)下降,在HBV相關(guān)HCC的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。
　　第二部分：乙型肝炎病毒X蛋白促p16IN4

9、A啟動(dòng)子甲基化及其機(jī)制的體外研究
　　目的:HBx可通過促進(jìn)某些抑癌基因啟動(dòng)子甲基化下調(diào)抑癌基因的表達(dá),但其具體機(jī)制卻不清楚。本研究旨在細(xì)胞水平明確HBx促進(jìn)p16IN4A啟動(dòng)子甲基化過程中甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶各自的作用,明確HBx介導(dǎo)的表觀遺傳修飾的可能機(jī)制。
　　方法:將含有HBx基因的質(zhì)粒pcDNA3.1(pcDNA3.1-HBx質(zhì)粒)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染L02細(xì)胞,HepG2細(xì)胞和BEL-7404細(xì)胞;各組細(xì)胞中p16IN4A

10、啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的檢測采用亞硫酸氫鹽測序法;熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測HBx,DNMT1,DNMT3A,DNMT3B和去甲基化酶MBD2的表達(dá);Western blot檢測HBx,DNMT1,DNMT3A和p16蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:在mRNA水平和蛋白水平,HBx均可上調(diào)DNMT1和DNMT3A的表達(dá):HBx可通過上調(diào)DNMT1和DNMT3A的表達(dá)從而促進(jìn)p16IN4A啟動(dòng)子甲基化;HBx可通過促進(jìn)p16IN4A啟動(dòng)子甲基化從而下