VDN大鼠血管鈣化不同階段基因表達譜的變化及初步分析.pdf

1、目的：
　　 探討VDN大鼠血管鈣化的不同階段基因譜表達的變化。
　　 方法：
　　 將24只SPF級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠（體重220g～260g）隨機分為對照組(Ctrl組)，血管鈣化8周組(VC8w組)，血管鈣化16周組(VC16w組)，每組8只。VC8w組和VC16w組大鼠制作VDN血管鈣化模型：維生素D3300KU/kg肌肉注射1次，尼古丁25mg/kg溶于花生油灌胃，9h后重復灌

2、胃1次。Ctrl組大鼠則予生理鹽水肌注1次及單純溶媒花生油間隔灌胃各1次。大鼠均普通飲食，相同條件飼養(yǎng)。VC8w組和Ctrl組大鼠于實驗第8周處死，VC16w組大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)至16周處死。分離各組大鼠腹主動脈，分別用HE染色和VonKossa染色，觀察血管鈣化的組織學改變。原子吸收分光光度法測定各組大鼠血管組織鈣含量。提取各組大鼠血管組織總RNA，逆轉錄成cDNA，進一步合成雙鏈cDNA(dscDNA)。將dscDNA用限制性核酸內切酶R

3、aslI切成短鈍頭末端，酶切后的目的dscDNA分成兩等份，在T4連接酶作用下分別連上接頭1R和接頭2R，將連有不同接頭的VC8w組和Ctrl組大鼠血管組織及VC16w組和VC8w組血管組織分別作正反雙向抑制消減交雜，得到消減cDNA片段，即初步消減文庫。在連接酶的作用下將差異表達cDNA片段與pMD-18T質粒載體連接成重組DNA分子，將重組載體導入感受態(tài)菌DH-5α以擴增文庫。隨機挑選克隆經菌落PCR鑒定為陽性克隆后送測序，將測序結

4、果通過Blastn與國際公共數據庫進行核酸序列同源性檢索和對比，分析檢索結果。挑選10個基因進行原組織RT-PCR驗證和DNA條帶半定量分析。
　　 結果：
　　 (1)組織病理檢查示Ctrl組大鼠動脈組織血管內皮及中膜彈力層完整，無鈣鹽沉積；VC8w組大鼠動脈中膜變形扭曲，棕褐色鈣鹽在動脈中膜呈線樣沉積，局部彈力板破壞；VC16w組大鼠較鈣化組相比，仍見鈣鹽沉積，但是可見鈣鹽沉積較為稀疏，并在鈣鹽沉積處見吞噬細胞。

5、r>　　 (2)組織鈣測定示Ctrl組、VC8w組和VC16w組大鼠血管組織鈣含量分別為(5.20±0.75)μg/mg、(15.34±2.51)μg/mg和(12.73±1.89)μg/mg。VC8w組大鼠血管組織鈣含量較Ctrl組明顯升高(P＜0.01);VC16w組大鼠血管組織鈣含量較VC8w組低（P＜0.05）。
　　 (3)經2套抑制消減雜交后獲得4個差異表達基因的cDNA文庫，分別為：VC8w組較Ctrl組高表達基

6、因cDNA文庫(VC8w-Ctrl)、VC8w組較Ctrl組低表達基因cDNA文庫(Ctrl-VC8w)、VC16w組較VC8w組高表達基因cDNA文庫(VC16w-VC8w)和VC16w組較VC8w組低表達基因cDNA文庫(VC8w-VC16w)。經過菌落PCR篩選，4個消減文庫獲得623個陽性克隆，克隆片段的長度在150～400bp左右。挑選216個陽性克隆成功測序。文庫(VC8w-Ctrl)經同源性檢索和比對最終確定43個差異表達

7、基因片段與已知全長基因具有高相似性，這些基因包括Bmp4、spock1、Cdh13、Tnfaip3等，檢索基因功能主要涉及骨化，其次有氧化、凋亡等；文庫(Ctrl-VC8w)經同源性檢索和比對最終確定差異表達基因片段11個，這些基因包括Atp1b1、Gimap等，下調基因功能主要與編碼ATP酶、GTP酶等有關；文庫(VC16w-VC8w)經同源性檢索和比對最終確定差異表達基因片段31個，包括Enpp1、Ggps1、Prps2、Ank2、

8、Abcc1等，基因功能主要與焦磷酸合成、谷氨酸信號相關，其次還有部分與氧化還原和凋亡調節(jié)有關；文庫(VC8w-VC16w)經比對后最終確定差異表達基因片段22個，包括Bmp15、Alpl、Colla2、Lox12，下調基因功能主要涉及骨化及氧化功能等。
　　 (4)對挑選的10個差異基因在原組織中進行驗證，RT-PCR及DNA條帶灰度值分析提示Prdx3、Ank2、Ror2、Abcc1、CytoP450、Nell1等10個基因均