大鼠不同階段生精細(xì)胞的差異表達(dá)基因的研究.pdf

1、分離得到單一的生精細(xì)胞群并建立單一細(xì)胞類型的cDNA文庫(kù),就可以特異性地研究單一細(xì)胞的基因表達(dá)和有效地篩選不同生精細(xì)胞群之間差異表達(dá)的基因.激光捕獲顯微切割技術(shù)（Laser Capture Microdissection,LCM）帶來了細(xì)胞分離技術(shù)的革命,它能夠快速、高效和精確地從復(fù)雜組織環(huán)境中捕獲分離單一細(xì)胞.該研究小組已經(jīng)成功地利用其捕獲和分離了大鼠初級(jí)鼠母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞.該實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上從分離的兩種細(xì)胞中提取RNA,合成雙鏈

2、cDNA,并進(jìn)一步通過抑制性消減雜交（Suppressive Subtractive Hybridization,SSH）方法構(gòu)建了大鼠初級(jí)精母細(xì)胞（RSA）和圓形精子細(xì)胞（RSB）的雙向cDNA消減文庫(kù).根據(jù)SSH的結(jié)果,選擇918個(gè)PCR純化產(chǎn)物（603個(gè)初級(jí)精母細(xì)胞差異表達(dá),315個(gè)圓形精子細(xì)胞差異表達(dá)）進(jìn)行斑點(diǎn)雜交（Dot Blotting）分析,以驗(yàn)證差異表達(dá)并分析其表達(dá)差異的強(qiáng)度.利用公共數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)圓形精子細(xì)胞差異表達(dá)的02

3、-66克隆進(jìn)行電子克隆,使用拼接引物PCR擴(kuò)增出cDNA并測(cè)序.測(cè)序全長(zhǎng)為564bp,編碼179個(gè)氨基酸,其核苷酸序列和GenBank中7個(gè)功能未知的序列高度同源.其編碼蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示其部分氨基酸序列和AhpC-TSA和Piwi有較高的結(jié)構(gòu)相似性.AhpC/TSA家族具有廣泛的細(xì)胞內(nèi)還原活性.Piwi基因編碼一種核質(zhì)蛋白,能夠通過體細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞自主調(diào)節(jié)雙重機(jī)制控制原始生殖細(xì)胞（germ-line stem cells,GSCs）