不同糖環(huán)境對FGL2基因沉默后的大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞全基因表達譜的影響.pdf

1、目的：心肌微血管內(nèi)皮細胞(Myocardial microvascular endothelial cells，MMVECs)是微血管的基本結(jié)構(gòu)，也是心臟重要的內(nèi)分泌器官。許多心血管系統(tǒng)疾病的致病因子以心肌微血管內(nèi)皮細胞作為靶器官;而心肌微血管內(nèi)皮細胞的結(jié)構(gòu)和功能障礙又是許多心血管疾病的起病原因。糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DC)是糖尿病的常見慢性并發(fā)癥，目前其發(fā)病機制尚未完全明確，高糖導(dǎo)致內(nèi)皮細胞功能

2、紊亂的機制尚不完全清楚。有研究表明，高血糖對微血管內(nèi)皮細胞的損傷可能是DC時心肌細胞損傷的促發(fā)因素。纖維蛋白原樣蛋白2(Fibrinogen-like protein2，F(xiàn)gl2)凝血酶原酶又稱纖維介素，是近年來熱點研究的凝血因子，涉及多種疾病的病理生理過程。本研究旨在通過高通量表達譜芯片技術(shù)，觀察不同葡萄糖濃度培養(yǎng)對Fgl2基因沉默的大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞全基因表達譜的影響，從分子水平探討糖環(huán)境和Fgl2基因?qū)ξ⒀軆?nèi)皮細胞功能影響可

3、能的基因和分子機制，為糖尿病心肌微血管病變的治療提供新的靶點和思路。
　　方法：⑴原代大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞的提取、培養(yǎng)和鑒定:取一周齡健康清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠，無菌條件下取出心臟，酶消化法培養(yǎng)原代MMVECs。待原代細胞單層融合后消化傳代，取第二代細胞經(jīng)免疫熒光法鑒定MMVECs特征性表面抗原CD31-RA和F(VIII)-RA。⑵按基因沉默設(shè)計原則構(gòu)建fgl2shRNA慢病毒表達載體和空載陰性對照，并

4、轉(zhuǎn)染MMVECs，免疫熒光鑒定是否轉(zhuǎn)染成功。⑶通過Ensembl數(shù)據(jù)庫查詢RGSC3.4版大鼠表達譜基因信息，應(yīng)用無膜芯片合成技術(shù)合成大鼠12×135K Array表達譜芯片，每個芯片含有26419個基因。單個基因在每張芯片上設(shè)計了3個以上的探針，提高檢測的準(zhǔn)確性。⑷實驗分組:取培養(yǎng)的第三代MMVECs，分為高糖培養(yǎng)和正糖培養(yǎng)兩大組。各包含三個亞組：單純培養(yǎng)組（空白對照組）；空載體轉(zhuǎn)染組(GFP組)；fgl2RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染組（fgl

5、2shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染組）。⑸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染72小時后，提取RNA，檢測RNA質(zhì)量;cDNA合成和標(biāo)記;將標(biāo)記好的探針和表達譜芯片雜交;圖像采集和數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果：①分離培養(yǎng)原代大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞成功，純度達95％以上，細胞形態(tài)表現(xiàn)出典型的“鋪路石樣”形態(tài)。②經(jīng)免疫熒光法檢測，細胞CD31、F(VIII)陽性率達90％以上。CD31主要呈紅色熒光分布在細胞膜中;F(VIII)主要呈綠色熒光分布在胞漿中。③經(jīng)酶切及DNA測序檢測f

6、gl2shRNA慢病毒表達載體構(gòu)建成功。經(jīng)fgl2shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染36h后，90％以上的MMVECs可觀察到綠色熒光蛋白顯影，證明病毒已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染入細胞內(nèi)。④表達譜芯片結(jié)果表明，高糖組和正糖組組內(nèi)對比全基因表達譜有明顯差異，病毒轉(zhuǎn)染組在高糖、正糖組間也有明顯差異。根據(jù)實驗分組對比，篩選出部分單純Fgl2基因沉默和單純糖環(huán)境引起的表達顯著差異基因。結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：成功培養(yǎng)大鼠原代心肌微血管內(nèi)皮細胞

7、;fgl2shRNA慢病毒載體構(gòu)建成功;成功用fgl2shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染MMVECs;高糖組、正糖組各組內(nèi)MMVECs全基因表達譜有明顯差異，證明Fgl2基因通過RNA干擾影響多個MMVECs基因的表達;fgl2shRNA慢病毒轉(zhuǎn)然后在不同糖環(huán)境下培養(yǎng)，MMVECs全基因表達譜有明顯差異，證明不同糖環(huán)境下生長的細胞其基因表達譜是有改變的。Fgl2基因通過RNA干擾對大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞的Smoc1、Scn7a、Epyc、Mal2、H