毛細(xì)管電泳監(jiān)測細(xì)胞凋亡過程中蛋白酶的活化過程.pdf

1、毛細(xì)管電泳（CE）是一種高靈敏、高分辨、高速度、低樣品消耗的微分離分析技術(shù)，已在生物、醫(yī)學(xué)、制藥、環(huán)境衛(wèi)生、食品等方面得到了深入的應(yīng)用，尤其是在生命科學(xué)領(lǐng)域。而蛋白組科學(xué)是現(xiàn)今生命科學(xué)研究中的重點之一，其中，酶活性研究更是研究者們關(guān)注的熱點前沿。許多重要疾病的發(fā)生發(fā)展與酶的異?；顒用芮邢嚓P(guān)。 Caspase是一類死亡特異性蛋白酶家族，可通過兩種基本的途徑——線粒體途徑和死亡受體途徑，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其中Caspase-3是兩條凋

2、亡途徑的匯合點。而Caspase-2在凋亡中的作用一直都存在很大的爭議。本文用CE監(jiān)測了細(xì)胞凋亡過程中Caspase-3和Caspase-2的活化過程，且Caspase-2的催化速度與Caspase-3相比有明顯的突躍，為抗腫瘤藥物篩選與評價提供了一種全新的方法。 為了監(jiān)測細(xì)胞凋亡過程中蛋白酶Caspase-3的活化過程，作者采用了一種融合熒光蛋白探針（ECFP-DEVD-DsRed）作為Caspase-3的底物。用熒光共振能

3、量轉(zhuǎn)移分子成像方法證明了此融合熒光蛋白在HeLa細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)的穩(wěn)定性與可靠性。當(dāng)用一定劑量的順鉑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞時，凋亡發(fā)生，Caspase-3被激活，其熒光底物被酶切成兩部分。用CE在體外分析了一系列不同誘導(dǎo)時間的HeLa細(xì)胞裂解液，定量描述了凋亡過程中Caspase-3的活化過程。為獲得滿意的分析結(jié)果，我們優(yōu)化了CE分離條件，如緩沖液類型、pH值、濃度和分離電壓。由于二元熒光蛋白探針的使用，強(qiáng)化了產(chǎn)物與底物之間的差異，使CE分離更容

4、易，并且能夠進(jìn)一步驗證實驗結(jié)果的可靠性。 同樣，為了監(jiān)測細(xì)胞凋亡過程中蛋白酶Caspase-2的活化過程，作者采用了另外一種融合熒光蛋白探針（ECFP-VDVAD-DsRed）作為Caspase-2的底物。當(dāng)用一定劑量的順鉑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞時，凋亡被啟動，Caspase-2被激活，其熒光底物被酶切成兩部分。通過CE分析一系列不同誘導(dǎo)時間的HeLa細(xì)胞裂解液，得出凋亡過程中Caspase-2的活化特性曲線。最后對單個HeLa細(xì)胞