高效毛細(xì)管電泳酶抑制劑篩選方法研究.pdf

1、在已經(jīng)上市的藥物當(dāng)中，以酶為靶點的藥物所占的比例高達(dá)五分之一，且當(dāng)今社會威脅人類生命健康的幾大主要疾病如腫瘤、糖尿病等都與酶的失調(diào)有重大關(guān)系，因此酶抑制劑的研發(fā)對于新藥研究有重要意義。目前常用的篩選酶抑制劑的方法有分光光度法、酶標(biāo)儀法等，分光光度法不能避免復(fù)雜基質(zhì)的影響，酶標(biāo)儀法因采用微孔板等耗材成本太高，而毛細(xì)管電泳具有高效、快速、試劑消耗量少等優(yōu)點，本論文意在通過高效毛細(xì)管電泳進(jìn)行酶抑制劑的研究，將其發(fā)展成為簡便可靠的高通量篩選平臺

2、，來用于創(chuàng)新藥物的研究開發(fā)。
　　第一部分:建立了一種新型的毛細(xì)管柱中在線反應(yīng)方法，以HDB作為離子鍵合劑構(gòu)建毛細(xì)管電泳固定化酶微反應(yīng)器，來篩選酪氨酸酶抑制劑。實驗過程中采用L-酪氨酸作為底物，考察了微反應(yīng)器的穩(wěn)定性為10次左右，優(yōu)化了孵育時間為2min，測定了酪氨酸酶酶活常數(shù)-米氏常數(shù)Km為0.5334mM，測定了陽性對照劑曲酸對游離酶的抑制常數(shù)為22.54uM，并確定了其抑制類型為混合型抑制，證實了該模型的可行性，并對18種金

3、屬配合物和13種中草藥的粗提物進(jìn)行了活性篩選，其中獨活和知母對酪氨酸酶有一定的抑制活性，抑制率依次為29.51％和47.34%。
　　第二部分:首次采用毛細(xì)管柱前反應(yīng)法來篩選二肽基肽酶抑制劑，實驗采用甘氨酰脯氨酸對硝基苯胺（Gly-Pro-PNA）為底物，實驗過程中優(yōu)化了底物和產(chǎn)物的分離條件、底物和酶的反應(yīng)條件，最終確定最優(yōu)條件為分離條件：運行緩沖液10mM NaH2PO4+10mM SDS pH7.5，溫度37℃，運行電壓30K

4、v，柱長40cm；反應(yīng)條件：85μL10mM NaH2PO4 pH7.5+10μL底物溶液+5μL酶溶液，反應(yīng)時間40min，檢測波長214nm和405nm。測定了二肽基肽酶的酶活性常數(shù)-米氏常數(shù)0.3708 mM，陽性對照劑-西他列汀對游離酶的抑制常數(shù)為1.2169mM，并確定了西他列汀的抑制類型為混合型抑制，證實了該方法的可行性，并對50種天然產(chǎn)物粗提物和16種化合物進(jìn)行了活性篩選，篩選出有活性的天然產(chǎn)物粗提物一個 TN-LGQ-9