塑化劑有毒代謝物MEHP誘導自噬參與胰島INS-1細胞氧化性DNA損傷機制探討.pdf

1、目的：鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯（Mono-(2-ethylhexyl) phthalate，MEHP）是鄰苯二甲酸（2-乙基己基）酯(di-(2-ethylhexyl) phthalate，DEHP)的有效毒性代謝產(chǎn)物。由于塑料產(chǎn)品中和日常飲食中DEHP越來越多的被使用，所以DEHP和其水解物MEHP對人體的傷害值得重視。已經(jīng)有研究表明鄰苯二甲酸酯類代謝物與很多慢性疾病有關(guān)，像肥胖和二型糖尿病等。而累積DNA損傷和一些氧化性損傷與

2、胰島素抵抗和肥胖的發(fā)生都有直接關(guān)系。近年來發(fā)現(xiàn)在DNA損傷的發(fā)生過程中還會檢測到自噬的發(fā)生，自噬的出現(xiàn)對細胞是有利還是有害不是完全清楚，其間作用的信號通路也不是很明朗。白藜蘆醇作為抗氧化劑可以消除細胞內(nèi)活性氧，達到化學預防的作用，對肥胖和糖尿病等慢性病有著積極的治療作用。所以在本實驗中，探究MEHP對INS-1細胞造成的DNA損傷，分析造成DNA損傷的機制途徑，同時還探究自噬的發(fā)生與DNA損傷的關(guān)系及其對細胞的影響；選用白藜蘆醇作為保護

3、劑，觀察其在MEHP產(chǎn)生細胞毒性過程中的作用。
　　方法：INS-1細胞被選為研究對象。MTT實驗用來檢測MEHP對INS-1細胞的毒性作用和對細胞生存率的影響；彗星實驗用來評定MEHP對INS-1細胞的遺傳毒性、DNA損傷水平；實時熒光定量PCR檢測INS-1細胞內(nèi)DNA損傷相關(guān)基因ATM和P53的表達量變化。檢測細胞內(nèi)ROS變化使用2',7'-二氯二氫熒光素熒光染料(DCFH-DA)，檢測溶酶體膜穩(wěn)定性用吖啶橙（AO），檢測線

4、粒體膜電位變化用JC-1染色，使用分光光度計和熒光顯微鏡觀察拍照。用蛋白印跡法檢測相關(guān)蛋白表達量變化。檢測白藜蘆醇和自噬抑制劑的作用都需要預先對細胞進行處理，再加MEHP作用。
　　結(jié)果：與對照組相比，MEHP作用后INS-1細胞產(chǎn)生明顯的DNA損傷，表現(xiàn)為彗星實驗中細胞拖尾現(xiàn)象加劇等，MEHP還導致細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平升高、溶酶體膜穩(wěn)定性下降、溶酶體內(nèi)組織蛋白酶 B釋放增多、線粒體膜電位崩潰以及自噬蛋白表達增加。經(jīng)白藜蘆醇

5、預處理后上述現(xiàn)象均減輕，經(jīng)自噬抑制劑預處理后自噬蛋白表達減少，細胞內(nèi)ROS水平反而增多。
　　結(jié)論：MEHP對INS-1細胞具有遺傳毒性。MEHP誘導產(chǎn)生的INS-1細胞DNA損傷是氧化應激造成的。MEHP誘導產(chǎn)生的INS-1細胞DNA損傷跟溶酶體-線粒體軸損傷有關(guān)。MEHP誘導產(chǎn)生INS-1細胞DNA損傷同時也誘導細胞自噬增加，而自噬對INS-1細胞在DNA損傷過程中起到一種保護作用。白藜蘆醇可以通過減輕氧化應激和恢復溶酶體-線