自噬在過表達TXNIP誘導的INS-1胰島細胞凋亡中的作用.pdf

1、研究背景：
　　隨著人口老齡化的發(fā)展，慢性疾病的發(fā)生率顯著提高，其中糖尿病已成為威脅我國人民健康的最重要疾病之一。2010年楊文英和2013年寧光教授的研究均顯示，我國已取代印度成為全球糖尿病患者人數最高的國家，而且糖尿病的發(fā)病率仍呈快速上升趨勢，并向中青年，甚至兒童蔓延。不論1型或2型糖尿病，各種原因導致的胰島β細胞數目減少和功能異常均是其發(fā)生和發(fā)展的重要原因。
　　硫氧還蛋白相互作用蛋白（Trx interacting

2、protein，TXNIP）在糖尿病的發(fā)病機制研究中的作用日益引起關注，它是目前已知唯一一個內源性硫氧還蛋白(Trx)結合及抑制蛋白，在糖尿病患者血清和組織中均呈現(xiàn)高表達。我們和他人課題組均研究證實了單純過表達TXNIP可以通過內質網應激介導的途徑、死亡受體途徑和線粒體凋亡途徑引起INS-1細胞凋亡增高。
　　自噬是在大部分真核細胞中經常觀察到的一種生命現(xiàn)象，可以清除降解細胞內受損的細胞器和不需要的生物大分子等以維持細胞內環(huán)境的穩(wěn)

3、態(tài)，減少細胞凋亡并起到保護細胞的作用，但也有研究表明，自噬水平的過度激活可促進凋亡的發(fā)生，而對器官組織造成額外的損傷。那么，TXNIP的升高對于自噬有何影響？其在TXNIP誘導的胰島β細胞凋亡中又有何作用？本研究將對這兩個問題進行探討。
　　目的：
　　本實驗旨在運用腺病毒轉染技術建立TXNIP過表達INS-1胰島細胞模型，觀察正常培養(yǎng)條件下單純過表達TXNIP的INS-1胰島細胞自噬水平的變化，以及探討自噬在TXNIP誘導

4、的INS-1胰島細胞凋亡中的作用。
　　方法：
　　1.使用腺病毒轉染技術對INS-1胰島細胞建立過表達TXNIP模型
　　選用處于對數生長期的INS-1胰島細胞，在25cm×25cm的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細胞長滿視野范圍80％時細胞數量約為2×106個，棄掉培養(yǎng)基，PBS沖洗兩次倒掉，隨機分為3組，即正常培養(yǎng)組（Control），不含TXNIP的空載體腺病毒對照組（Ad-eGFP），含有TXNIP的過表達組（Ad-TXN

5、IP-eGFP）。按感染復數MOI=50計算病毒量進行病毒轉染，先將計算出的病毒體積加入1ml的1640中培養(yǎng)細胞，4h后補3ml含有10%胎牛血清和雙抗的1640繼續(xù)培養(yǎng)，于48小時轉染效率最高時收集細胞。
　　2.檢測指標
　　2.1應用實時定量PCR和Western blot方法檢測INS-1胰島細胞TXNIP mRNA的水平以及蛋白表達量。
　　2.2用流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況。
　　2.3應用We

6、stern blot方法測定各組細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、P62以及cleaved caspase3/caspase3的表達。
　　2.4使用激光共聚焦顯微鏡觀察自噬體的變化。
　　結果：
　　1. INS-1胰島細胞過表達TXNIP成功
　　與Control組相比，Ad-eGFP組TXNIP mRNA和蛋白水平未見明顯差別，與Ad-eGFP組相比，Ad-TXNIP-eGFP組TXNIP m

7、RNA（圖1）和蛋白水平明顯增高（圖2），說明病毒構建成功、病毒轉染目的蛋白造模成功。
　　2.過表達TXNIP引起INS-1胰島細胞凋亡增加。
　　使用 Annexin V-APC/7-AAD染色經流式細胞術檢測凋亡表明Ad-TXNIP-eGFP組細胞凋亡率增多：與Ad-eGFP組相比，Ad-TXNIP-eGFP組細胞凋亡率增多，而Ad-eGFP組與Control組無明顯差異（圖4）。
　　Ad-TXNIP-eGFP

8、組cleaved caspase3/caspase3比值增高:cleaved caspase3的生成是凋亡的共同通路，與Control組相比， Ad-eGFP組cleaved caspase3/caspase3比值未見統(tǒng)計學差異；與Ad-eGFP組相比，Ad-TXNIP-eGFP組顯著增高（圖3），進一步證實了TXNIP的上調可引起INS-1胰島細胞的凋亡增加。3. TXNIP表達上調可引起INS-1胰島細胞自噬水平的升高。
　　

9、與Control組相比， Ad-eGFP組的自噬標志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平、Beclin-1蛋白水平未見明顯差別，與Ad-eGFP相比，Ad-TXNIP-eGFP組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平是升高的（圖5），Beclin-1蛋白水平也增多（圖6），二者增多說明自噬反應生成增多。由于P62是自噬降解的底物，隨自噬的加強，其水平逐漸降低，是自噬檢測的常用標志物，與Control組相比，Ad-eGFP組P62蛋白水平未見統(tǒng)計學差

10、異，與Ad-eGFP組相比，Ad-TXNIP-eGFP組P62蛋白水平降低（圖7），表明自噬溶酶體降解增多，自噬反應增多。
　　4.激光共聚焦顯微鏡下觀察到Ad-TXNIP-eGFP組自噬體增多
　　使用LC3B多克隆抗體對自噬細胞進行染色，共聚焦顯微鏡下攝片并分析：Control組和Ad-eGFP組之間染色所呈的紅色熒光無顯著差別，均很弱；與Control組和Ad-eGFP組相比，Ad-TXNIP-eGFP組自噬熒光顯著增

11、強，細胞內出現(xiàn)了明顯的紅色熒光，表明過表達TXNIP促進自噬體生成（圖8）。
　　5.3-MA（5mM）抑制自噬后TXNIP上調引起的INS-1胰島細胞凋亡減少。
　　5.13-MA（5mM）抑制了TXNIP上調引起的INS-1胰島細胞自噬水平的升高。
　　為了證實自噬的改變在TXNIP上調引起的INS-1胰島細胞凋亡中的作用，采用了自噬抑制劑3-methyladenine(3-MA)進行干預，將細胞進一步分組為：Co

12、ntrol組、Ad-eGFP組、Ad-TXNIP-eGFP組、Control+3-MA組、Ad-eGFP+3-MA組、Ad-TXNIP-eGFP+3-MA組，對前述幾個自噬標志物的檢測結果顯示：Control+3-MA與Control組相比無統(tǒng)計學差異；Ad-eGFP+3-MA組與Ad-eGFP組相比也無統(tǒng)計學差異；與Ad-TXNIP-eGFP組相比，Ad-TXNIP-eGFP+3-MA組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯降低（圖9），Be

13、clin-1表達明顯降低（圖10），而P62表達明顯增多（圖11），以上結果說明，3-MA抑制了TXNIP過表達誘導的自噬發(fā)生。
　　5.2自噬抑制后TXNIP上調引起的INS-1胰島細胞凋亡減少。
　　使用 Annexin V-APC/7-AAD染色，流式細胞術檢測凋亡的結果顯示：Control+3MA組與Control組相比無統(tǒng)計學差異；Ad-eGFP+3-MA組與Ad-eGFP組相比無統(tǒng)計學差異；Ad-TXNIP-eG

14、FP+3-MA組與 Ad-TXNIP-eGFP組相比INS-1細胞凋亡減輕（圖13）。使用Western blot對cleaved caspase3/caspase3的檢測也取得類似結果，Ad-TXNIP-eGFP+3MA組cleaved caspase3/caspase3比值明顯降低（圖12），同樣表明使用自噬抑制劑后，TXNIP誘導的細胞凋亡減輕。
　　結論：
　　1.在INS-1細胞單純過表達TXNIP可以誘導自噬增加