肝細(xì)胞核因子HNF1α在非酒精性脂肪性肝病發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、[研究背景及目的]
　　隨著全球肥胖人群的不斷增多，非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liverdisease，NAFLD)已成一種常見疾病，其發(fā)病呈現(xiàn)出逐年遞增的趨勢(shì)。近年來，多項(xiàng)研究證明，NAFLD患者常與肥胖、高血糖、高血脂、高血壓等疾病伴隨發(fā)生，與2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus，T2DM)、代謝綜合征以及心、腦血管疾病密切相關(guān)。NAFLD和T2DM的共同發(fā)病機(jī)制是胰島素

2、抵抗，兩者相互促進(jìn)，相互惡化，已成為近年來臨床治療的新挑戰(zhàn)。
　　肝細(xì)胞核因子（hepatocyte nuclear factor，HNFs）是一類在肝臟優(yōu)勢(shì)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，目前已發(fā)現(xiàn)的HNF成員包括5種，它們分別是HNF1、HNF3、HNF4、HNF6以及CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBP)。HNFs通過準(zhǔn)確調(diào)控下游多種重要的肝細(xì)胞功能基因表達(dá)，在肝臟發(fā)育和肝細(xì)胞分化以及功能維持中起關(guān)鍵作用。其中HNF1α是HNFs家族的主

3、要成員之一，屬于POU-同源結(jié)構(gòu)域家族。HNF1α在肝臟中表達(dá)水平最高，在腎臟、小腸、胰腺β細(xì)胞中也有一定的表達(dá)，它對(duì)肝臟中許多的重要功能基因進(jìn)行調(diào)控，對(duì)肝臟的發(fā)育中是不可或缺的。以往針對(duì)HNF1α的研究中分為兩方面:(1) HNF1α全身敲除小鼠出現(xiàn)高血糖和高脂血癥。(2) HNF1α基因失活突變后，異常的HNF1α蛋白抑制肝臟脂肪酸結(jié)合蛋白(L-FABP)的功能，使肝細(xì)胞脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能損害，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積。以上研究結(jié)果提示

4、HNF1α可能是脂肪肝和糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中的抑制因子，但該推論還需進(jìn)一步證實(shí)。
　　基于以上研究背景，本研究首先通過建立NAFL模型小鼠，觀察HNF1α在其肝臟中的表達(dá)變化，分析相關(guān)性;利用Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)，首次獲得了肝細(xì)胞特異性敲除HNF1α小鼠，通過該小鼠研究分析HNF1α在NAFLD形成過程中發(fā)揮的作用，探究胰島素抵抗和血糖升高是否會(huì)促進(jìn)NAFLD患者肝臟出現(xiàn)不良結(jié)局，如肝硬化或肝癌等;運(yùn)用腺相關(guān)病毒特異性上調(diào)肝

5、細(xì)胞中HNF1α表達(dá)，觀察其是否能改善NAFLD癥狀;利用以上模型進(jìn)一步探索其中的機(jī)制。
　　[實(shí)驗(yàn)方法]
　　一、 HNF1α在NAFL模型小鼠肝臟中的表達(dá)情況
　　利用高脂飼料建立了非酒精性脂肪肝模型小鼠。利用IPGTT方法檢測(cè)小鼠末梢血糖情況，通過肝組織病理學(xué)染色觀察肝臟形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，從而判斷造模是否成功。提取肝臟組織RNA，通過Real-time PCR檢測(cè)肝組織中糖脂代謝基因ACC、FAS、SREBP-1c、G

6、CK、PEPCK和炎癥因子TNFα、TGFβ、IL-6的表達(dá)量，提取肝臟組織RNA和蛋白，利用Real-time PCR、western blot和免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)肝組織中HNF1α的表達(dá)水平。
　　二、特異性調(diào)控肝細(xì)胞HNF1α對(duì)小鼠非酒精性脂肪性肝病發(fā)生發(fā)展的作用
　　1、Hnf1αH-KO小鼠的建立
　　利用基因打靶技術(shù)建立Hnf1αf/f小鼠，將Hnf1αf/f小鼠與Alb-Cre小鼠雜交，獲得的雜合子小

7、鼠之間再次雜交后，可獲得Hnf1αf/f和Hnf1αH-KO兩種基因型小鼠。通過鼠尾DNA抽提，普通PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因和瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)小鼠基因型，并根據(jù)結(jié)果將Hnf1αf/f和Hnf1αH-KO兩種基因型小鼠進(jìn)行區(qū)分并分組。
　　2、各組織和肝細(xì)胞中HNF1α表達(dá)情況的檢測(cè)
　　提取Hnf1αf/f和Hnf1αH-KO小鼠肝臟、胰腺、小腸和腎臟組織RNA和蛋白，利用Real-time PCR、western bl

8、ot和免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)HNF1α mRNA和蛋白的表達(dá)水平。分離Hnf1αf/f和Hnf1αH-KO小鼠原代肝細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，提取細(xì)胞中的蛋白，利用western blot方法檢測(cè)HNF1α蛋白的表達(dá)水平。
　　3、Hnf1αH-KO小鼠肝臟形態(tài)學(xué)表現(xiàn)及糖脂代謝基因檢測(cè)
　　處死10周齡、30周齡Hnf1αf/f和Hnf1αH-KO小鼠，通過肝組織病理學(xué)染色觀察肝臟形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，并進(jìn)行病理學(xué)評(píng)估。收集Hnf1αf/f和

9、Hnf1αH-KO小鼠血清，檢測(cè)小鼠血清中CHOL、TG、LDL-C3和ALT的表達(dá)水平。利用Hnf1αf/f和Hnf1αH-KO小鼠肝組織勻漿檢測(cè)肝組織中TG表達(dá)量。提取Hnf1αf/f和Hnf1αH-KO小鼠肝臟RNA和蛋白，利用Real-time PCR和western blot方法，檢測(cè)糖脂代謝相關(guān)基因ACC、SREBP-1c、FAS、GCK、GCKR和纖維化相關(guān)基因Collagen1、α-SMA的表達(dá)水平。
　　4、于N

10、AFL模型小鼠中特異性上調(diào)肝細(xì)胞HNF1α表達(dá)
　　(1)空白對(duì)照組(CTR AAV-TBG)的建立:普通飼料喂養(yǎng)C57BL/6小鼠5只，于第10周尾靜脈AAV-TBG（2×1011 Vg/只，1次），于第20周時(shí)處死小鼠
　　(2)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的建立（HFD AAV-TBG&HFD AAV-HNF1α）:高脂飼料喂養(yǎng)C57BL/6小鼠建立NAFL模型小鼠，于高質(zhì)飲食第10周將NAFL模型小鼠隨機(jī)分為2組，每組各5只，分別

11、通過尾靜脈注射AAV-TBG和AAV-HNF1α(2×1011 Vg/只，1次)，于第20周處死各組小鼠
　　5、觀察NAFL模型小鼠肝細(xì)胞過表達(dá)HNF1α后肝臟形態(tài)學(xué)表現(xiàn)及肝臟糖脂代謝基因的檢測(cè)
　　取CTR AAV-TBG組、HFD AAV-TBG組和HFD AAV-HNF1α組小鼠肝組織進(jìn)行病理學(xué)染色并觀察肝臟形態(tài)學(xué)變化。提取以上三組小鼠肝組織中RNA和蛋白，利用Real-time PCR和western blot方法

12、，檢測(cè)糖脂代謝相關(guān)基因ACC、SREBP-1c、FAS、GCK、GCKR和纖維化相關(guān)基因Collagen1、α-SMA的表達(dá)水平。
　　三、HNF1α抑制非酒精性脂肪性肝病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究
　　1、利用10周齡、30周齡和70周齡Hnf1αH-KO小鼠，通過Real-time PCR和免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)肝組織中炎癥因子TNFα、TGFβ、IL-6的mRNA和蛋白水平，通過western blot方法檢測(cè)肝組織STAT3

13、和p65的蛋白水平。
　　2、利用10周齡Hnf1αH-KO小鼠原代肝細(xì)胞，通過Real-time PCR方法檢測(cè)原代肝細(xì)胞中炎癥因子TNFα、TGFβ、IL-6的mRNA水平，通過western blot方法檢測(cè)原代肝細(xì)胞中STAT3和p65的蛋白水平。
　　3、利用CTR AAV-TBG組、HFD AAV-TBG組和HFD AAV-HNF1α組小鼠，利用免疫組化方法，檢測(cè)肝臟內(nèi)炎癥因子TNFα、TGFβ、IL-6的蛋白表

14、達(dá)，通過western blot方法檢測(cè)肝臟內(nèi)STAT3和p65的蛋白水平。
　　五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS18.0軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析，多組間采用One-WayANOVA分析，配對(duì)資料采用配對(duì)t檢驗(yàn)，方差非齊性則采用非參數(shù)檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以X±SD表示，P＜0.05具有顯著差異，P＜0.01具有非常顯著差異。
　　[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]
　　一、HNF1α在NAFL模型小鼠肝臟中的表達(dá)情況
　　(1) NA

15、FL模型小鼠肝臟出現(xiàn)大量脂質(zhì)沉積，于高脂飲食30wk時(shí)小鼠血糖升高，出現(xiàn)肝纖維化;
　　(2)與對(duì)照組小鼠相比，NAFL模型小鼠肝臟脂質(zhì)合成相關(guān)基因ACC、FAS和SREBP-1c等mRNA的表達(dá)明顯升高;
　　(3)與對(duì)照組小鼠相比，NAFL模型小鼠糖代謝關(guān)鍵酶GCK mRNA的表達(dá)顯著降低，糖異生關(guān)鍵限速酶PEPCK mRNA的表達(dá)明顯升高;
　　(4)與對(duì)照組小鼠相比，NAFL模型小鼠炎癥因子TNFα、TGFβ和

16、IL-6 mRNA的表達(dá)明顯升高;
　　(5)與對(duì)照組小鼠相比，NAFL模型小鼠HNF1α基因mRNA的表達(dá)量在高脂飲食10wk時(shí)出現(xiàn)一過性升高后，于高脂飲食30wk時(shí)明顯下調(diào)，western blot和免疫組化進(jìn)一步確定NAFL模型小鼠肝臟中HNF1α的蛋白水平于高脂飲食30wk時(shí)表達(dá)顯著下降。
　　二、特異性調(diào)控肝細(xì)胞HNF1α對(duì)小鼠非酒精性脂肪性肝病發(fā)生發(fā)展的作用
　　1、Hnf1αH-KO小鼠各組織和肝細(xì)胞中H

17、NF1α表達(dá)的檢測(cè)
　　(1)與Hnf1αf/f小鼠相比，Hnf1αH-KO小鼠肝臟中HNF1α mRNA和蛋白的表達(dá)明顯下降;
　　(2)與Hnf1αf/f小鼠相比，Hnf1αH-KO小鼠小腸、腎臟和胰腺中HNF1α mRNA和蛋白水平的表達(dá)沒有變化;
　　(3)與Hnf1αf/f小鼠相比，Hnf1αH-KO小鼠原代肝細(xì)胞中HNF1α蛋白水平的表達(dá)明顯降低;
　　(4)與Hnf1αf/f小鼠相比，Hnf1αH-

18、KO小鼠非實(shí)質(zhì)細(xì)胞中HNF1α蛋白水平的表達(dá)沒有變化。
　　2、Hnf1αH-KO小鼠血脂、肝功能及血糖情況的檢測(cè)
　　(1)與Hnf1αf/f小鼠相比，Hnf1αH-KO小鼠于10周齡時(shí)出現(xiàn)血清總膽固醇(CHO-C3)明顯升高、低密度脂蛋白(LDL-C3)降低;
　　(2)與Hnf1αf/f小鼠相比，Hnf1αH-KO小鼠谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)明顯升高;
　　(3)與Hnf1αf/f小鼠相比，Hnf1α

19、H-KO小鼠IPGTT檢測(cè)顯示，30周齡Hnf1αH-KO小鼠血糖水平分別于葡萄糖注射后60分鐘和90分鐘時(shí)升高。
　　3、Hnf1αH-KO小鼠肝臟形態(tài)學(xué)表現(xiàn)及糖脂代謝基因檢測(cè)
　　(1)與Hnf1αf/f小鼠相比，10周齡Hnf1αH-KO小鼠出現(xiàn)肝臟脂質(zhì)沉積，30周齡Hnf1αH-KO小鼠肝臟脂質(zhì)沉積加重，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，出現(xiàn)肝纖維化，70周齡Hnf1αH-KO小鼠發(fā)生高分化型肝細(xì)胞癌;
　　(2)與Hnf1αf/

20、f小鼠相比，Hnf1αH-KO小鼠肝臟脂質(zhì)合成相關(guān)基因ACC、FAS和SREBP-1c mRNA的表達(dá)明顯升高，Hnf1αH-KO小鼠肝臟內(nèi)TG含量明顯升高;
　　(3)與Hnf1αf/f小鼠相比，Hnf1αH-KO小鼠糖代謝關(guān)鍵酶GCK的mRNA表達(dá)量明顯降低，GCK-GCKR比例明顯降低;
　　4、NAFL模型小鼠肝細(xì)胞過表達(dá)HNF1α后肝臟內(nèi)HNF1α表達(dá)的檢測(cè)
　　(1)與CTR AAV-TBG組小鼠相比，HF

21、D AAV-TBG組小鼠中肝臟內(nèi)HNF1αmRNA的表達(dá)明顯下降;
　　(2)與HFD AAV-TBG組小鼠相比，HFD AAV-HNF1α組小鼠肝臟內(nèi)HNF1α在mRNA和蛋白水平均明顯升高，并且高于CTR AAV-TBG組小鼠肝臟內(nèi)HNF1α的表達(dá)水平。
　　5、NAFL模型小鼠肝細(xì)胞過表達(dá)HNF1α后肝臟形態(tài)學(xué)表現(xiàn)和糖脂代謝相關(guān)基因的檢測(cè)
　　(1)與HFD AAV-TBG組小鼠相比，HFD AAV-HNF1α組

22、小鼠脂肪肝癥狀明顯改善，肝臟內(nèi)未出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，未見肝臟內(nèi)纖維化形成;
　　(2)與HFD AAV-TBG組小鼠相比，HFD AAV-HNF1α組小鼠SREBP-1c、FAS和ACC mRNA的表達(dá)水平和肝組織TG含量明顯降低;
　　(3)與HFD AAV-TBG組小鼠相比，HFD AAV-HNF1α組小鼠中GCK mRNA的表達(dá)明顯升高，GCK-GCKR比例明顯升高。
　　三、HNF1α抑制非酒精性脂肪性肝病發(fā)生發(fā)

23、展的機(jī)制研究
　　1、Hnf1αH-KO小鼠肝組織中炎癥因子和NF-κB、STAT3信號(hào)通路的檢測(cè)
　　(1)與Hnf1αf/f小鼠相比，Hnf1αH-KO小鼠肝組織中TNFα、TGFβ1和IL-6 mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯升高;
　　(2)與Hnf1αf/f小鼠相比，Hnf1αH-KO小鼠肝組織中STAT3和p65磷酸化水平明顯升高。
　　2、Hnf1αH-KO小鼠肝細(xì)胞中炎癥因子和NF-κB、STAT3信

24、號(hào)通路的檢測(cè)
　　(1)與Hnf1αf/f小鼠相比，Hnf1H-KO小鼠肝細(xì)胞中TNFα、TGFβ1和IL-6 mRNA表達(dá)水平明顯升高;
　　(2)與Hnf1αf/f小鼠相比，Hnf1αH-KO小鼠肝組織中STAT3和p65磷酸化水平明顯升高。
　　3、特異性上調(diào)NAFL模型小鼠肝細(xì)胞中HNF1α后肝臟內(nèi)炎癥因子和NF-κB、STAT3信號(hào)通路的檢測(cè)
　　(1)與HFD AAV-TBG組小鼠相比，HFD AAV

25、-HNF1α組小鼠肝組織中TNFα、TGFβ1和IL-6的蛋白水平明顯降低;
　　(2)與HFD AAV-TBG組小鼠相比，HFD AAV-HNF1α組小鼠肝組織中STAT3和p65的磷酸化水平明顯降低。
　　[結(jié)論]
　　1、HNF1α在NAFLD小鼠肝組織中表達(dá)顯著降低，與血糖升高和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。
　　2、肝細(xì)胞特異性缺失HNF1α后小鼠自發(fā)NAFLD，并最終進(jìn)展為肝細(xì)胞癌，提示HNF1α在NAFLD發(fā)生