IRX3在非酒精性脂肪性肝病和肝細胞癌中的作用及機制的研究.pdf

1、第一部分 Irx3促進肝內(nèi)脂質(zhì)蓄積和肝脂肪變的研究
　　目的：研究Irx3在肝內(nèi)脂質(zhì)代謝中的作用及其分子機制。
　　方法：通過尾靜脈注射過表達或沉默Irx3的腺病毒及對照腺病毒的方法，在小鼠體內(nèi)上調(diào)或下調(diào)Irx3的表達，并給予正?；蚋咧嬍?2周，檢測小鼠肝組織學變化、脂質(zhì)蓄積情況及脂滴相關(guān)蛋白的表達水平。在轉(zhuǎn)染Irx3過表達腺病毒或?qū)φ障俨《镜男∈蟾渭毎?，下調(diào)Fsp27β或Perilipin1的表達，并給予400μmol

2、/l油酸誘導，檢測肝細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積情況。此外，我們使用染色質(zhì)免疫共沉淀和報告基因熒光素酶檢測等分子生物學的方法，研究Irx3是否能夠轉(zhuǎn)錄激活Fsp27β或Perilipin1的表達。
　　結(jié)果：上調(diào)肝內(nèi) Irx3的表達可促進肝內(nèi)脂質(zhì)蓄積和肝脂肪變，以及增加 Fsp27β和Perilipin1的表達；相反，下調(diào)肝內(nèi)Irx3的表達可抵抗高脂飲食誘導的肝脂肪變，降低Fsp27β和Perilipin1的表達水平。但是脂滴相關(guān)蛋白Cidea

3、、Cideb、Atgl、Cgi-58和Perilipin2-4的表達不受Irx3表達變化的影響。與對照腺病毒轉(zhuǎn)染的肝細胞相比，Irx3過表達腺病毒轉(zhuǎn)染的肝細胞內(nèi)TG含量明顯增加，但是在腺病毒介導的Irx3過表達的肝細胞內(nèi)下調(diào)Fsp27β或Perilipin1的表達，導致細胞內(nèi)TG含量顯著性降低。染色質(zhì)免疫共沉淀和報告基因熒光素酶檢測結(jié)果顯示，Irx3能與Fsp27β和Perilipin1的基因啟動子片段結(jié)合，而過表達Irx3增強Fsp2

4、7β和Perilipin1的基因啟動子報告基因的熒光素酶活性。
　　結(jié)論：Irx3通過轉(zhuǎn)錄激活Fsp27β和Perilipin1的表達，促進肝內(nèi)脂質(zhì)蓄積和肝脂肪變。
　　第二部分 IRX3在肝細胞癌中的作用及表達調(diào)控研究
　　目的：研究IRX3在肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）中的作用，并從miRNA的角度探討其表達調(diào)控機制。
　　方法：采用qRT-PCR和Western bl

5、ot方法檢測HCC細胞系（HepG2和SMMC7721）和永生化肝細胞系LO2中IRX3和miR-377表達水平；慢病毒轉(zhuǎn)染HCC細胞構(gòu)建IRX3穩(wěn)定表達和沉默的穩(wěn)定細胞株HepG2-shIRX3和SMMC7721-IRX3；采用CCK-8和克隆形成實驗檢測細胞的增殖和克隆形成能力；采用劃痕實驗和 Transwell侵襲實驗檢測細胞遷移和侵襲能力；將miR-377 mimics或Control mimics轉(zhuǎn)染入HCC細胞，QRT-PC

6、R和Western blot方法檢測miR-377對IRX3的調(diào)控作用；運用報告基因技術(shù)證實miR-377是否可直接結(jié)合IRX33’UTR；將miR-377 mimics轉(zhuǎn)染入SMMC7721-IRX3細胞，CCK8、克隆形成、劃痕和Transwell實驗觀察miR-377是否能拮抗IRX3對細胞增殖、遷移和侵襲的促進作用。
　　結(jié)果：HepG2和SMMC7721細胞中IRX3 mRNA和蛋白水平均顯著高于LO2細胞；CCK-8實

7、驗結(jié)果顯示，與陰性對照相比，上調(diào)IRX3顯著提高了SMMC7721細胞的生長，而下調(diào)IRX3抑制了HepG2細胞的生長；克隆形成實驗顯示，SMMC7721-IRX3細胞比對照細胞產(chǎn)生了更多的細胞克隆，HepG2-shIRX3細胞產(chǎn)生的細胞克隆少于對照細胞；劃痕實驗和Transwell實驗顯示，上調(diào)IRX3顯著增強了SMMC7721的遷移和侵襲能力，而下調(diào) IRX3顯著降低了 HepG2細胞的遷移和侵襲能力；miR-377在HepG2和S

8、MMC7721細胞中低表達；與轉(zhuǎn)染Control mimics相比，轉(zhuǎn)染了miR-377 mimics的HepG2和SMMC7721細胞中IRX3的蛋白表達水平明顯降低，mRNA水平無明顯差異；報告基因?qū)嶒烇@示，miR-377顯著降低了IRX3-3’UTR-WT的熒光素酶活性，而IRX3-3’UTR-MUT不受miR-377影響；miR-377過表達消除了過表達IRX3對SMMC7721細胞增殖、遷移和侵襲的促進作用。
　　結(jié)論：