烏骨藤提取物抑制新生血管生成的機(jī)制研究.pdf

1、目的：烏骨藤提取物能抑制腫瘤血管生成，但其機(jī)制不明確。本研究通過觀察烏骨藤提取物(Marsdenia tenacissima extract，MTE)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HumanUmbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC)增殖、遷移、凋亡及新生血管生成的影響探討其作用機(jī)制。
　　方法：對(duì)HUVEC進(jìn)行培養(yǎng)，采用MTS法檢測(cè)MTE對(duì)細(xì)胞增殖的作用;采用劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移的變化;采用Hoechst

2、/PI熒光染色法及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡及周期;采用ATP、葡萄糖檢測(cè)試劑盒觀察細(xì)胞代謝產(chǎn)物變化;采用qRT-PCR檢測(cè)HUVEC相關(guān)基因的表達(dá)及采用雞胚(Chick ChorioallantoicMembrane，CAM)實(shí)驗(yàn)觀察新生血管的生成。
　　結(jié)果：MTE對(duì)HUVEC增殖的抑制作用顯著，且隨濃度的升高其對(duì)細(xì)胞的抑制率逐步增強(qiáng)（**P＜0.01），抑制作用呈劑量依賴效應(yīng)。體外細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，MTE處理組的遷移能力明顯低

3、于對(duì)照組，進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)MTE能夠抑制HUVEC的遷移運(yùn)動(dòng)。Hoechst/PI熒光染色法顯示:MTE濃度達(dá)到160μg/mL時(shí)，細(xì)胞核被Hoechst染成亮藍(lán)色，PI復(fù)染呈特征性的細(xì)胞凋亡形態(tài);流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，MTE能促進(jìn)HUVEC的早期凋亡，將細(xì)胞周期阻滯在S期。不同濃度 MTE處理24h后，觀察ATP代謝及葡萄糖消耗情況，證實(shí)MTE處理后ATP/ADP代謝及葡萄糖消耗水平呈下降趨勢(shì)，具有顯著性差異（*P＜0.05），表

4、明MTE能夠通過抑制HUVEC代謝導(dǎo)致細(xì)胞增殖減少。半定量RT-PCR檢測(cè)MTE作用于HUVEC后相關(guān)基因的表達(dá)，顯示MTE能上調(diào)Caspase-3，PICK1和ICA69，LC3-Ⅱ，Beclin-1和PTEN基因的mRNA表達(dá)水平，下調(diào)Bcl-2，VEGFR，P2Y6R，CCL-2,AKT和mTOR基因的mRNA表達(dá)，表明MTE能夠影響HUVEC細(xì)胞中數(shù)個(gè)凋亡和遷移相關(guān)基因的表達(dá)。通過qRT-PCR相對(duì)定量檢測(cè)mRNA顯示:MTE處