烏骨藤注射液對(duì)Bel-7402細(xì)胞增殖及血管生成作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、1.目的： 近年來(lái)，抗腫瘤血管生成已成為腫瘤治療的基礎(chǔ)和臨床研究熱點(diǎn)，是最有希望的腫瘤導(dǎo)向治療靶標(biāo)，與傳統(tǒng)的腫瘤治療相比，抗腫瘤血管生成治療的最大特點(diǎn)在于它不但具有良好的特異性，而且克服了藥物達(dá)到腫瘤組織的不足和腫瘤耐藥性等問(wèn)題。我國(guó)的中醫(yī)藥治療與血管生成相關(guān)的病癥有著悠久的歷史，具有不同于西醫(yī)的特殊性，并在這些病癥的治療上有極大的優(yōu)勢(shì)。因此，研究中藥抗腫瘤血管生成，在闡明中醫(yī)基礎(chǔ)理論、臨床治療及中藥研究中具有十分重要的意義。烏

2、骨藤，又叫通光藤，為蘿藦科牛奶菜屬植物，主產(chǎn)于云南、貴州，據(jù)記載：該藥始載于《滇南本草》，性味苦，微甘、涼，入肺胃膀胱經(jīng)；具有止咳平喘、消炎鎮(zhèn)痛、通乳利尿等功效，用于治療慢性支氣管炎。民間用烏骨藤治療癌癥獲得良效，引起廣大醫(yī)藥工作者的關(guān)注。本試驗(yàn)旨在研究并證明傳統(tǒng)中藥烏骨藤抗腫瘤活性，從血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶-2以及抑癌基因p53等角度探討烏骨藤的抗腫瘤作用機(jī)制。 2.方法： 2.1 M

3、TT法 采用四氮唑鹽(MTT)還原法測(cè)定不同濃度的烏骨藤注射液的體外對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel-7402細(xì)胞增殖的影響，并根據(jù)吸光度(OD)值作圖得到劑量-效應(yīng)圖譜。 2.2 PI單染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡和周期 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度的烏骨藤注射液對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel-7402凋亡和周期的影響。 2.3 ELASI法 利用ELASI試劑盒檢測(cè)不同濃度的烏骨藤注射液對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel-7402不同時(shí)間段表達(dá)VE

4、GF的影響。 2.4免疫細(xì)胞化學(xué)法 采用細(xì)胞免疫化學(xué)S-P染色法檢測(cè)不同濃度的烏骨藤注射液作用于人肝癌細(xì)胞Bel-7402后b-FGF和MMP-2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率。 2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抑癌基因p53蛋白的表達(dá) 采用流式細(xì)胞術(shù)，通過(guò)間接熒光標(biāo)記法測(cè)定不同濃度的烏骨藤注射液作用于人肝癌細(xì)胞Bel-7402后p53蛋白的表達(dá)情況。p53蛋白熒光指數(shù)(FluoresenceIndex，F(xiàn)I)表示定量的p53蛋白

5、。綠熒光LOG收集的熒光強(qiáng)度峰值數(shù)轉(zhuǎn)化成線性刻度，對(duì)照管作為陰性表達(dá)FI=1。FI計(jì)算公式如下：FI=檢測(cè)管細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度/對(duì)照管細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度。如FI>1.0為陽(yáng)性表達(dá)，F(xiàn)I≤1.0為陰性表達(dá)。 3.結(jié)果： 3.1不同濃度的烏骨藤注射液(10mg/ml、20mg/ml、40mg/ml)對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel-7402均有抑制作用，且呈劑量時(shí)間依賴，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有差異。 3.2人肝癌細(xì)胞Bel-7402經(jīng)不同濃度

6、的烏骨藤注射液(20mg/ml、40mg/ml、80mg/ml)作用后，細(xì)胞凋亡率明顯上升，且呈劑量依賴，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有意義。然而，細(xì)胞周期變化不大，未證實(shí)細(xì)胞被阻滯于特定周期。 3.3利用ELASI試劑盒檢測(cè)不同濃度的烏骨藤注射液(10mg/ml、20mg/ml、40mg/ml)作用于人肝癌細(xì)胞Bel-7402后VEGF的表達(dá)情況，隨著藥物濃度的增加，VEGF表達(dá)逐漸減少，且與陰性對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 3.4免疫

7、細(xì)胞化學(xué)的結(jié)果顯示，不同濃度的烏骨藤注射液(10mg/ml、20mg/ml、40mg/ml)作用于人肝癌細(xì)胞Bel-7402后，與陰性對(duì)照組相比，b-FGF和MMP-2的表達(dá)均有所減少，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有差異。 3.5流式細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)p53蛋白的結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加，熒光強(qiáng)度增加，p53峰總體向右偏移。根據(jù)FI計(jì)算公式計(jì)算出FI值，經(jīng)不同濃度的烏骨藤注射液作用24h后，p53均陽(yáng)性表達(dá)，且FI值隨劑量的增加而增高。