內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在大鼠酒精性肝病肝細(xì)胞調(diào)亡中的作用.pdf

1、目的:酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是因長(zhǎng)期過(guò)量飲酒引起的中毒性肝臟疾病。其包括輕癥ALD、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化等類型。ALD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前尚不完全清楚,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ehdoplasmic reticulum stress,ERS)及其介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡可能在其中發(fā)揮重要作用。
　　 ERS指由于各種原因?qū)е录?xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能發(fā)生紊亂,鈣穩(wěn)態(tài)失衡,錯(cuò)誤折

2、疊或未折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)聚集的一種亞細(xì)胞器的病理狀態(tài),它是使錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)恢復(fù)正確構(gòu)象并能夠進(jìn)一步加工的必需步驟。ERS是體內(nèi)的一種自我保護(hù)機(jī)制,但如果ERS反應(yīng)過(guò)強(qiáng)或持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),肝細(xì)胞所受損傷過(guò)于嚴(yán)重,則會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序,最終導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡,從而加重肝臟病變。
　　 以往的研究證實(shí),在ALD中,高同型半胱氨酸血癥(Hyperhomocysteinemia,Hhcy)可誘發(fā)ERS。胱硫醚β合成酶(cystathionin

3、e beta-synthase,CBS)為吡哆醛磷酸依賴性酶,主要在肝臟中合成,是同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶,其活性的降低可能是導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥的重要原因。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白-78(glucose-regulated protein,GRP78),是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)駐留最多的一種分子伴侶。應(yīng)激狀態(tài)下,GRP78大量表達(dá),與未折疊蛋白結(jié)合,恢復(fù)蛋白質(zhì)的正確構(gòu)象。因此,GRP78被認(rèn)為是ERS的標(biāo)志性分子。

4、ERS介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡過(guò)程包括細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡及一系列的酶促反應(yīng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。需鈣蛋白酶2(calpain2)和caspase-12是存在于肝細(xì)胞中的半胱氨酸蛋白酶類,可能在此過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究擬用酒精灌胃的方法建立大鼠酒精性肝病模型,檢測(cè)血清總同型半胱氨酸(tHcy)的濃度和肝組織CBS的活性;分別用免疫組化法和RT-PCR法檢測(cè)肝組織中GRP-78、calpain2、caspase-12蛋白和mRNA的表達(dá)變化;應(yīng)用TUNEL

5、染色法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡。以探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡在大鼠酒精性肝病中發(fā)揮的作用。
　　 方法:選用雄性Wister大鼠50只,體重200±20g,正常飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分出10只為對(duì)照組,其余動(dòng)物采用逐漸增加酒精濃度(濃度30％-60％,乙醇5-9g·kg-1·d-1)的方法進(jìn)行酒精灌胃,分別于4周、8周、12周和16周末禁食12小時(shí)后隨機(jī)處死動(dòng)物9只、9只、8只和8只(大鼠在造模過(guò)程中死亡6只),留取血清及肝組織標(biāo)本;檢測(cè)

6、血清ALT、AST、TG、TC、HDL、LDL、VLDL、tHcy等生化指標(biāo);用比色法測(cè)定肝組織勻漿CBS的活性。取部分肝組織冰凍切片行蘇丹Ⅳ染色,觀察肝細(xì)胞脂肪變性情況;另取肝組織制作石蠟切片,分別行蘇木精.伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色、天狼紅染色、過(guò)碘酸希夫染色(PAS),觀察肝組織普通病理改變,纖維化程度和肝組織胞漿糖原變化;分別用免疫組織化學(xué)染色及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcripti

7、on-polymerase chain reaction,RT-PCR)的方法,檢測(cè)肝組織中GRP-78、calpain2、caspase-12蛋白和mRNA的表達(dá)情況。采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果:
　　 1、血清肝功能指標(biāo)的變化:隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),血清ALT和AST水平逐漸升高,CHE水平降低,與正常對(duì)照組比較P＜0.05或P＜0.01。
　　

8、2、血清血脂指標(biāo)的變化:隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),血清TG、TC、LDL、VLDL的水平逐漸升高,HDL水平逐漸降低,與正常對(duì)照組比較P＜0.05或P＜0.01。
　　 3、肝組織病理學(xué)改變:光鏡下,HE染色顯示對(duì)照組肝組織肝細(xì)胞索以肝小葉中央靜脈為中心呈放射樣排列;隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),出現(xiàn)肝細(xì)胞腫脹,肝小葉內(nèi)可見(jiàn)肝細(xì)胞小泡性脂肪變性、凋亡小體和壞死灶;模型16周組大鼠肝細(xì)胞彌漫性小泡性脂肪變性,竇周纖維化,匯管區(qū)纖維組織增生并有纖維

9、間隔形成,可見(jiàn)多量凋亡小體和壞死灶。冰凍切片蘇丹Ⅳ染色顯示正常對(duì)照組大鼠肝組織無(wú)脂肪變性,隨著造模時(shí)間延長(zhǎng),肝細(xì)胞內(nèi)有紅色脂滴分布,并逐漸增多,至16周大鼠肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅色脂滴。PAS染色顯示對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)大量紫紅色顆粒,模型16周僅見(jiàn)少量紫紅色顆粒分布。天狼紅染色顯示模型4周組大鼠肝組織無(wú)明顯纖維組織增生,隨著造模時(shí)間延長(zhǎng),纖維間隔逐漸形成,模型16周組大鼠肝組織出現(xiàn)明顯纖維間隔。
　　 4、血清總同型半胱氨酸

10、(tHcy)濃度的變化:隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),血清tHcy的濃度逐漸升高,與正常對(duì)照組比較P＜0.01。
　　 5、肝組織CBS活性的變化:隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),肝組織勻漿CBS的活性逐漸下降,與正常對(duì)照組比較P＜0.05或P＜0.01。
　　 6、免疫組化法檢測(cè)大鼠肝組織GRP-78、calpain2、procaspase-12蛋白的表達(dá):光鏡下,正常組大鼠肝臟內(nèi)表達(dá)較少的GRP-78、calpain2蛋白,隨著造模時(shí)間的

11、延長(zhǎng)GRP-78、calpain2蛋白陽(yáng)性表達(dá)逐漸增加,主要表達(dá)于肝細(xì)胞胞漿內(nèi),光鏡下對(duì)照組大鼠肝組織有較多procaspase-12的表達(dá),主要表達(dá)于肝細(xì)胞胞漿內(nèi),隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)陽(yáng)性表達(dá)逐漸減弱。與正常對(duì)照組比較P＜0.01。
　　 7、RT-PCR法檢測(cè)GRP-78、calpain2、caspase-12 mRNA的表達(dá)量:正常組大鼠肝組織中表達(dá)GRP-78、calpain、caspase-12mRNA較少,隨著造模時(shí)間

12、的延長(zhǎng),GRP-78、calpain、caspase-12mRNA表達(dá)量逐漸增加,與正常對(duì)照組比較P＜0.01。
　　 8、TUNEL染色法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡指數(shù):在正常對(duì)照組僅有極少量肝細(xì)胞凋亡,隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),肝細(xì)胞凋亡指數(shù)呈上升趨勢(shì),與對(duì)照組相比,P＜0.01。
　　 9、肝組織中CBS的表達(dá)量與血清tHcy水平呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.632,P＜0.01。
　　 10、血清tHcy水平與肝組織中GRP-

13、78的相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.617,P＜0.01。
　　 11、肝細(xì)胞凋亡指數(shù)與calpain2和caspase-12mRNA表達(dá)呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.959和0.887,P值均小于0.01。
　　 結(jié)論:
　　 1、應(yīng)用逐漸增加酒精濃度和劑量灌胃的方法可以成功制備大鼠ALD模型,該模型肝臟病變?nèi)缰咀冃?、炎癥反應(yīng)和纖維化等可以反映臨床ALD的基本病變。
　　 2、在大鼠ALD模型中,C