丁苯酞、卡馬西平對大鼠海馬、小腦神經(jīng)元凋亡及認知功能影響的研究.pdf

1、目的:
　　卡馬西平(Carbamazepine，CBZ)又稱酰胺咪嗪，與三環(huán)類抗抑郁藥結(jié)構(gòu)相似，通過阻斷電壓依賴性鈉離子通道，減少突觸前谷氨酸(Glu)釋放和細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平，增加腦內(nèi)5-羥色胺(5-HT)水平，從而降低神經(jīng)元興奮性。CBZ作為一線抗癲癇藥物(antiepileptic drugs，AEDS)，因其價格低廉，療效顯著，臨床應用非常廣泛。但AEDS療程長、依從性差且個體間不良反應差異大、副作用多，癥

2、狀表現(xiàn)各異，可累及多個器官及系統(tǒng)。
　　丁苯酞(dl-3-n-butylphthalide，NBP)在改善腦缺血、促進腦缺血后神經(jīng)功能恢復方面有明顯效果，近期研究證明，NBP不僅從形態(tài)和功能上對線粒體發(fā)揮保護作用，還可以降低神經(jīng)細胞凋亡百分率，并能上調(diào)大鼠缺血腦組織中的BDNF的表達，達到神經(jīng)保護作用。
　　為排除癲癇發(fā)作本身對認知功能及凋亡的損害，了解CBZ對認知損傷的差異性，本實驗以形態(tài)學為基礎(chǔ)，通過觀察CBZ及NBP對

3、大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、小腦神經(jīng)細胞凋亡及認知的影響，探討CBZ對神經(jīng)系統(tǒng)毒副作用以及NBP抑制凋亡、改善認知的作用機制，為更好地指導臨床用藥、減少藥物不良反應提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1實驗動物及分組:7周齡健康雄性成熟SD(Sprague-Dawley)大鼠（河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供）36只，實驗起始體重150～190g;自然晝夜，22～25℃環(huán)境喂養(yǎng)，每籠6只，換氣扇通風，標準飼料喂養(yǎng)，自由進食和飲水。隨

4、機分為YY組（NS+花生油），NBP組(NBP+花生油+NS組)，C1組(CBZ低劑量+NS+花生油組)，C2組（CBZ高劑量+NS+花生油），NC1組(CBZ低劑量+NS+NBP+花生油)，NC2組（CBZ高劑量+NS+NBP+花生油），每組6只。按人與大鼠給藥劑量的換算公式（以公斤體重計算，大鼠的劑量為人用藥劑量的6.25倍），具體為低劑量CBZ125mg/kg/d，NBP80mg/kg/d，高劑量CBZ采取LD50的1/8，具體劑

5、量為高劑量CBZ500mg/kg/d，一天一次灌胃器灌胃30天。
　　2灌注及取材:10％的水合氯醛麻醉后仰臥固定，剪開胸骨，暴露心臟，灌注針經(jīng)心尖部入左心室經(jīng)主動脈瓣入升主動脈，同時剪開右心耳放血，先快速注入生理鹽水，以止血鉗夾固灌注針，右心耳流出無色液體后，用4％的多聚甲醛固定，待灌注成功后立即斷頭取材，放入4％的多聚甲醛固定液中進行固定24小時。標本經(jīng)過脫水、透明、石蠟包埋及切片，供HE、尼氏染色、免疫組化測定使用。另外每組

6、隨機選取2只大鼠麻醉后用1％多聚甲醛-1.25％戊二醛0.1M磷酸緩沖液灌流固定后，取大鼠海馬區(qū)域的腦組織標本，經(jīng)透射電子顯微鏡觀察海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元及小腦浦肯野細胞結(jié)構(gòu)。
　　3凋亡及認知指標測定:大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)及小腦皮質(zhì)浦肯野細胞蠟切片經(jīng)HE染色光鏡下觀察大鼠腦組織的形態(tài)學變化，尼氏染色觀察尼氏小體的變化，水迷宮觀察大鼠認知行為學的變化，免疫組化染色法觀察凋亡相關(guān)基因Bax及Bcl-2的表達情況和認知相關(guān)基因B

7、DNF的表達情況。
　　4統(tǒng)計學處理:應用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理。多組間均數(shù)顯著性檢驗應用One-Way ANOVA，其中方差齊性資料采用SNK檢驗進行兩兩組間比較;非齊性資料用Tamhane'S T2檢驗，當P＜0.05時認為差異具有顯著性。
　　結(jié)果:
　　1 HE染色結(jié)果
　　1.1海馬CA1及CA3區(qū):各組腦組織結(jié)構(gòu)完整，細胞密集，排列整齊。偶見細胞皺縮，與周圍細胞分離，嗜酸性染色增強，細胞核

8、、染色質(zhì)聚集成團塊狀，與YY組相比，無明顯形態(tài)學改變。
　　1.2小腦浦肯野細胞:各組可見浦肯野細胞密集，排列整齊，偶見細胞體積縮小，與YY組相比，無明顯形態(tài)學差異。
　　2尼氏染色結(jié)果
　　2.1海馬CA1及CA3區(qū):各組海馬錐體細胞密度大且排列規(guī)則，細胞質(zhì)染色清晰，呈均勻一致的紫藍色，胞漿中可見尼式小體，神經(jīng)元未見異常形態(tài)改變。
　　2.2小腦浦肯野細胞:Nissl染色能顯示浦肯野細胞胞體及與連接胞體的主樹突

9、，胞質(zhì)中可見成斑塊狀堆積的藍紫色尼體小體，胞核及其核仁清晰可見，神經(jīng)元未見異常形態(tài)改變。
　　3免疫組化染色法檢測Bax、Bcl-2及BDNF表達結(jié)果
　　3.1 Bax表達結(jié)果
　　3.1.1海馬CA1區(qū):CBZ組可見Bax表達陽性細胞明顯增多，胞漿呈棕黃色，染色較深。YY組和NBP組可見Bax表達陽性細胞稀疏、散在分布，且染色淺淡。通過采用Image Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)測定Bax表達陽性細胞的平均光

10、密度值（OD值），C1組與C2組相比Bax表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，該兩組的Bax表達比其余四組均增高，與其余四組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01); NC1組與NC2組相比Bax表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，該兩組與C1組與C2組相比的Bax表達減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，與YY組與NBP組相比Bax表達增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
　　3.1.2海馬CA3區(qū):各組均可見少量、散在

11、分布的Bax表達陽性細胞，測定Bax表達陽性細胞的OD值，C1組與C2組相比Bax表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，該兩組的Bax表達比其余四組均增高，與其余四組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01); NC1組與NC2組相比Bax表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），該兩組與C1組及C2組相比的Bax表達減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），與YY組及NBP組相比Bax表達增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
　　3.

12、1.3小腦浦肯野細胞區(qū):NC1組與NC2組相比Bax表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，該兩組與C1組及C2組相比Bax表達減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），與YY組及NBP組相比Bax表達增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);NBP組比YY組Bax表達減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　3.2 Bcl-2表達結(jié)果
　　3.2.1海馬CA1區(qū):C1組和C2組Bel-2表達陽性細胞顯著增多，胞質(zhì)呈棕黃色或

13、褐色，染色較深。NBP組和YY組Bcl-2表達陽性細胞稀疏、散在分布，細胞著色淺淡。CBZ+NBP組Bel-2表達陽性細胞著色較CBZ組明顯稍淺。通過采用Image Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)測定Bcl-2表達陽性細胞的平均光密度值（OD值），各組之間相比存在差異，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　3.2.2海馬CA3區(qū):各組均可見Bcl-2表達陽性細胞廣泛分布，胞質(zhì)深染呈棕黃色或褐色，測定Bcl-2表達陽性細胞的

14、OD值，各組之間Bcl-2表達存在差異但無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　3.2.3小腦浦肯野細胞區(qū):各組之間Bcl-2表達存在差異但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　3.3 BDNF表達結(jié)果
　　3.3.1海馬CA1區(qū):在放大400倍的光學顯微鏡下觀察，BDNF免疫組織化學陽性細胞主要集中在海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)錐體細胞，表現(xiàn)為整個細胞胞漿著色呈棕黃色，各組均可見BDNF表達，表達量較高，各組OD值相比，但差異均

15、無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　3.3.2海馬CA3區(qū):各組均可見BDNF表達，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　3.3.3小腦浦肯野細胞區(qū):BDNF在海馬表達的最多，浦肯野細胞的BDNF表達明顯減少。對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析得出:各組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　4水迷宮結(jié)果
　　4.1水迷宮逃避潛伏期結(jié)果:從訓練的第2天開始，六組大鼠逃避潛伏期均有下降的趨勢，說明訓練可以增強學

16、習記憶能力，各組大鼠通過4天的訓練，建立了空間記憶(p＜0.01)，但各組大鼠間學習記憶能力無明顯不同（P＞0.05）。
　　4.2水迷宮穿越平臺次數(shù)結(jié)果:各組之間穿越平臺次數(shù)的均數(shù)比較存在差異，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　5透射電鏡觀察結(jié)果
　　5.1海馬CA1區(qū):各組海馬CA1區(qū)細胞大體結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)異常，細胞內(nèi)神經(jīng)元核膜清晰，核質(zhì)均勻，核膜無內(nèi)陷，胞質(zhì)中細胞器豐富，胞質(zhì)內(nèi)可見大量的核糖體，線粒體無腫脹、線粒

17、體嵴無斷裂，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池無擴張。
　　5.2小腦浦肯野細胞區(qū):各組浦肯野細胞細胞大體結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)異常。細胞內(nèi)神經(jīng)元核膜清晰，核質(zhì)均勻，核膜無內(nèi)陷，胞質(zhì)中細胞器豐富。
　　結(jié)論:
　　1灌服常規(guī)劑量卡馬西平，對正常成年SD大鼠海馬及小腦Bax、Bcl-2表達有影響，對神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)及認知功能無明顯改變，說明卡馬西平短期服用對神經(jīng)元的損害可能是可逆的，且機體的自身調(diào)節(jié)使凋亡難度增加，可能是一種機體對藥物損害的保護性反應;