丁苯酞對(duì)STZ糖尿病大鼠認(rèn)知功能障礙及CaMK Ⅱ表達(dá)的影響.pdf

1、目的:糖尿病會(huì)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生損害，形成糖尿病腦病(diabetic encephalopathy)，臨床上表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙。研究顯示海馬突觸可塑性的變化與糖尿病認(rèn)知功能障礙有關(guān)。鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶-Ⅱ（calcium/calmodulin-de pendprotein kinase-Ⅱ，CaMKⅡ）是調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶與突觸可塑性的重要蛋白因子。CaMKⅡ的含量間接反映了學(xué)習(xí)記憶的能力。本實(shí)驗(yàn)旨在探討丁苯酞對(duì)鏈脲佐菌素(strep

2、tozotocin，STZ)糖尿病大鼠認(rèn)知功能障礙以及CaMKⅡ的影響。
　　 方法:
　　 1、制備STZ糖尿病大鼠模型及分組:
　　 健康雄性(Sprague-Dawley，SD)大鼠55只（體重140-160g），隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組，n=10只)，糖尿病組（n=45只），糖尿病組大鼠空腹過(guò)夜后一次性腹腔注射STZ60mg/kg，72h后于尾靜脈測(cè)隨機(jī)血糖，血糖≥16.7mmol/l視為造模成功。成模

3、后將糖尿病組大鼠隨機(jī)分為糖尿病對(duì)照組(DC，n=15)，糖尿病丁苯酞低劑量組（DL組，n=15），糖尿病丁苯酞高劑量組(DH組，n=15)。
　　 2、干預(yù):
　　 動(dòng)物成模后，給予NC組等量玉米胚芽油灌胃，給予DC組等量玉米胚芽油灌胃，給予DL組丁苯酞(60mg/kg)+等量玉米胚芽油灌胃給予，DH組丁苯酞(120mg/kg)+等量玉米胚芽油灌胃，每日1次，歷時(shí)12周。
　　 3、一般情況觀察:
　　

4、觀察并記錄大鼠精神狀態(tài)及進(jìn)食、飲食、尿量等一般情況，檢測(cè)并記錄血糖、體重變化。
　　 4、行為學(xué)檢測(cè):
　　 各組大鼠于成模12周后分別進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，包括前5天的定位航行實(shí)驗(yàn)以記錄逃避潛伏期及第6天的空間探索實(shí)驗(yàn)以記錄60s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)。
　　 5、制備標(biāo)本及觀察指標(biāo):
　　 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束次日，處死大鼠，取海馬組織，行HE染色觀察海馬組織形態(tài)，行實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(R-TPCR)

5、檢測(cè)CaMKⅡmRNA水平以及免疫組織化學(xué)分析、蛋白免疫印跡法(Western-blot)檢測(cè)細(xì)胞CaMKⅡ蛋白表達(dá)。
　　 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:
　　 所得數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包理，應(yīng)用兩個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)、完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析、重復(fù)測(cè)量方差分析、秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示結(jié)果，應(yīng)用P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、一般情況觀察
　　 正常

6、對(duì)照組大鼠血糖正常、皮毛光亮、體重穩(wěn)定增長(zhǎng)、反應(yīng)靈敏等。糖尿病大鼠血糖明顯升高（＞20.0mmol/l），具備糖尿病的典型癥狀如多尿、多飲、多食等，逐漸出現(xiàn)皮毛枯黃、生長(zhǎng)緩慢、體重下降、反應(yīng)遲鈍等現(xiàn)象。干預(yù)過(guò)程中，丁苯酞高劑量組大鼠一般情況比丁苯酞低劑量組好。
　　 2、Morris水迷宮結(jié)果
　　 基礎(chǔ)游泳速度:各組大鼠游泳速度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 位航行實(shí)驗(yàn):與正常對(duì)照組相比，糖尿病對(duì)照組逃避潛伏期延長(zhǎng)(P＜

7、0.05)，提示成模后12周，糖尿病大鼠出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙;與糖尿病對(duì)照組相比，丁苯酞低劑量組、丁苯酞高劑量組逃避潛伏期縮短(P＜0.05);與丁苯酞低劑量組相比，丁苯酞高劑量組逃避潛伏期在第1天和第2天無(wú)顯著差異，第3天到第5天逃避潛伏期縮短(P＜0.05)，不同天數(shù)的潛伏期長(zhǎng)短差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，第1天＞第2天＞第3天＞第4天＞第5天，天數(shù)和分組之間不存在交互作用。
　　 空間探索實(shí)驗(yàn):與正常對(duì)照組相比，糖尿病對(duì)

8、照組、丁苯酞低劑量組、丁苯酞高劑量組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)減少(P＜0.05);與糖尿病對(duì)照組相比，丁苯酞低劑量組、丁苯酞高劑量組大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)增加(P＜0.05);與丁苯酞低劑量組相比，丁苯酞高劑量組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)增加(P＜0.05)。
　　 3、海馬組織HE染色結(jié)果
　　 正常對(duì)照組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，排列整齊;糖尿病組細(xì)胞排列紊亂，胞體縮小，胞質(zhì)紅色，正常形態(tài)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少。丁苯酞低劑量組

9、和丁苯酞高劑量組細(xì)胞形態(tài)正常，排列較整齊，結(jié)構(gòu)較為完整。
　　 4、免疫組化結(jié)果
　　 糖尿病對(duì)照組海馬CaMKⅡ蛋白表達(dá)量較正常對(duì)照組降低(P＜0.01);丁苯酞低劑量組和丁苯酞高劑量組的CaMKⅡ表達(dá)量均比糖尿病對(duì)照組增高(P＜0.01);丁苯酞高劑量組的CaMKⅡ表達(dá)量高于丁苯酞低劑量組(P＜0.01)。
　　 5、Rt-PCR結(jié)果
　　 糖尿病對(duì)照組海馬CaMKⅡ表達(dá)量較正常對(duì)照組降低(P＜0.0

10、5);丁苯酞低劑量組和丁苯酞高劑量組的CaMKⅡ表達(dá)量均比糖尿病對(duì)照組增高(P＜0.01，P＜0.05);丁苯酞高劑量組的CaMKⅡ表達(dá)量高于丁苯酞低劑量組(P＜0.01)。
　　 6、Western blot結(jié)果
　　 糖尿病對(duì)照組的CaMKⅡ蛋白表達(dá)量低于正常對(duì)照組(P＜0.01);丁苯酞低劑量組和丁苯酞高劑量組的CaMKⅡ蛋白表達(dá)量與糖尿病對(duì)照組相比均增高(P＜0.01);丁苯酞高劑量組的CaMKⅡ蛋白表達(dá)量高于丁