丁苯酞對苯妥英鈉引起的SD大鼠海馬、小腦神經(jīng)細胞凋亡影響的研究.pdf

1、目的:丁苯酞（dl-3-n-butylphthalide，NBP）是人工合成的消旋體，臨床常用于缺血性腦血管病的治療，對腦神經(jīng)組織細胞具有保護作用。在臨床上，苯妥英鈉(Phenytoin sodium，PHT)常用于癲癇、心律失常、三叉神經(jīng)痛等疾病，其中以抗癲癇應用最為常見;但其治療譜狹窄，易出現(xiàn)神經(jīng)毒性，不良反應較多，如眩暈、共濟失調(diào)、言語不清等。而本實驗主要研究丁苯酞對苯妥英鈉作用后的大鼠海馬、小腦神經(jīng)細胞Bax和Bcl-2的表達，

2、探討苯妥英鈉的毒副作用及丁苯酞的神經(jīng)保護機制。
　　方法:
　　1、分組及給藥:健康的清潔級8周齡雄性SD大鼠36只，重量為（170±20g），隨機分為NS（生理鹽水+花生油）組、NBP（丁苯酞+生理鹽水）組、PHT高劑量組、PHT低劑量組、PHT高劑量+NBP混合組和PHT低劑量+NBP混合組，每組各6只。采用自己制作的灌胃針在9:00-11:00Am進行灌胃。PHT組、NBP+PHT組中的PHT按高、低劑量分別給200m

3、g/kg/d、100mg/kg/d，同時其它組給予等量生理鹽水;NBP（用食用花生油溶解）80mg/kg，同時其它組給予等量的花生油灌胃，每天1次，共30天。
　　2、取材及檢測:用10％水合氯醛(0.36ml/100g)麻醉各組大鼠，使其仰臥，并固定，剖開胸腔，暴露大鼠心臟，從心尖處插入灌注針，同時從右心耳處剪開心臟放血。先快速以0.9％生理鹽水(100ml～150ml)沖洗，再用4％多聚甲醛磷酸緩沖液(200ml～300ml)

4、固定。注射完畢后立即斷頭，迅速取出其大腦和小腦，放入4％的多聚甲醛固定，常規(guī)乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸臘，包埋，選取大腦和小腦連續(xù)冠狀切片，片厚5μm。通過HE及尼氏染色觀察各組神經(jīng)細胞凋亡和變性的情況，通過免疫組化檢測各組神經(jīng)細胞Bax、Bcl-2蛋白陽性表達情況并以平均光密度值(AOD)表示各組結(jié)果。
　　3、統(tǒng)計分析:使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，多組間均數(shù)采用One-Way ANOVA檢驗比較，各組均數(shù)間兩兩

5、比較采用SNK檢驗，當P＜0.05時，認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1、HE染色結(jié)果
　　NS組及NBP組大鼠海馬和小腦神經(jīng)元排列整齊緊密，細胞結(jié)構清晰，胞漿紅染胞核藍染，胞核圓形或橢圓形，核仁清晰，形態(tài)正常，偶見幾個凋亡細胞，其細胞輪廓模糊，細胞體積縮小，細胞核固縮深染，胞質(zhì)嗜酸性染色增強，周圍空泡形成。PHT低劑量組海馬及小腦神經(jīng)元排列比較稀疏，輪廓模糊，細胞核固縮深染，且周圍空泡形成，凋亡細胞較多。NB

6、P+PHT低劑量組海馬及小腦神經(jīng)元排列尚整齊，結(jié)構尚完整，較PHT低劑量組細胞凋亡程度輕。PHT高劑量組海馬及小腦有大量凋亡細胞，其神經(jīng)元細胞排列散亂，稀疏，細胞體積縮小，核不規(guī)則，大量細胞核固縮深染，胞漿嗜伊紅。NBP+PHT高劑量組較PHT高劑量組海馬及小腦神經(jīng)細胞凋亡程度輕。
　　2、尼氏染色結(jié)果
　　NS組及NBP組大鼠海馬和小腦神經(jīng)元排列規(guī)則緊密，且形態(tài)完整、核仁清晰，胞漿內(nèi)尼氏體豐富，沒有明顯神經(jīng)元丟失。與NS組

7、和NBP組相比，PHT低劑量組和PHT高劑量組大鼠海馬和小腦神經(jīng)元丟失較明顯，細胞分布不均，可見細胞皺縮，染色質(zhì)凝集成塊、核固縮、尼氏小體數(shù)量減少，其中PHT高劑量組神經(jīng)元丟失更為明顯。NBP+PHT低劑量組與NS組和NBP組相比，海馬及小腦神經(jīng)元沒有明顯丟失。NBP+PHT高劑量組海馬及小腦神經(jīng)元丟失較PHT高劑量組明顯減少。
　　3、免疫組化染色結(jié)果
　　3.1 Bax蛋白表達結(jié)果
　　Bax蛋白的陽性表達為棕黃色

8、或棕色顆粒，主要分布在細胞胞膜和胞漿內(nèi)，細胞核不著色。
　　NS組和NBP組海馬及小腦神經(jīng)細胞偶可見陽性細胞表達;NBP+PHT低劑量組（NP1組）海馬及小腦神經(jīng)細胞可見少量陽性細胞表達，NBP+PHT高劑量組(NP2組)海馬及小腦神經(jīng)細胞陽性細胞表達明顯增多;PHT高劑量組（NP2組）和PHT低劑量組(NP1組)海馬及小腦神經(jīng)細胞可見大量的陽性細胞表達，且分布密集，胞漿呈棕黃色，染色深，其中PHT高劑量組（P2組）尤為顯著。NB

9、P組、NS組與NP1組中任意兩組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。P1組、P2組、NP2組任意兩組比較，其差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05):P1組Bax蛋白陽性細胞表達低于P2組(P＜0.05)，NP2組陽性細胞表達低于P1組(P＜0.05)，NP2組陽性細胞表達低于P2組（P＜0.05）。P1組與NP1組比較，其差異有統(tǒng)計學意義，NP1組陽性細胞表達低于P1組（P＜0.05）。NP1組與NP2組比較，其差異有統(tǒng)計學意義，N

10、P1組陽性細胞表達低于NP2組(P＜0.05)。
　　3.2各組實驗大鼠Bcl-2蛋白表達
　　Bcl-2蛋白的陽性表達為棕色顆粒，呈重染，主要分布在細胞胞漿核膜，細胞核不著色。
　　NS組與NBP組海馬及小腦神經(jīng)細胞的陽性細胞表達明顯;PHT低劑量組及PHT高劑量組海馬及小腦神經(jīng)細胞均少量表達，其中高劑量組陽性細胞表達減少更明顯;NBP+PHT低劑量組海馬及小腦神經(jīng)細胞陽性細胞表達明顯;NBP+PHT高劑量組海馬及小

11、腦神經(jīng)細胞陽性細胞表達增多。NBP組、NS組與NP1組中任意兩組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);P1組、P2組、NP2組任意兩組比較，其差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05):P1組Bcl-2蛋白陽性細胞表達高于P2組(P＜0.05)，NP2組陽性細胞表達高于P1組(P＜0.05)，NP2組陽性細胞表達高于P2組(P＜0.05)。P1組與NP1組比較，其差異有統(tǒng)計學意義，且NP1組陽性細胞表達高于P1組(P＜0.05)。NP1組

12、與NP2組比較，其差異有統(tǒng)計學意義，NP1組陽性細胞表達高于NP2組（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、不同治療劑量PHT均可導致正常大鼠海馬、小腦神經(jīng)細胞凋亡，其抑制凋亡蛋白Bcl-2表達減少，促凋亡蛋白Bax表達增多;其高劑量組影響更明顯，呈劑量相關性。
　　2、NBP+PHT高、低劑量組分別與PHT高、低劑量組相比海馬、小腦神經(jīng)細胞Bcl-2表達均增多，Bax表達均減少，細胞凋亡受到抑制。NBP可能通過提高B