葡激酶模擬肽的研究.pdf

1、血栓栓塞是多種心血管疾病的主要發(fā)病原因之一。目前，已有多種溶栓制劑如組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、鏈激酶(SK)、尿激酶(UK)及其突變體等被用于治療血栓性疾病，它們能有效降低病人的致死率和致殘率。但是，目前的溶栓劑仍存在著再通不完全、初始再灌注延遲、血栓再形成、出血和過(guò)敏反應(yīng)等缺陷。葡激酶(Staphylokinase,Sak)具有與組織型纖溶酶原激活劑相當(dāng)?shù)娜芩ɑ钚?，并有更高的纖維蛋白專(zhuān)一性，能以大腸桿菌為宿主通過(guò)基因工程菌大量

2、制備，是一種很有應(yīng)用前景的溶栓劑?，F(xiàn)有主要溶栓劑t．PA、SK、UK、APSAC等均是靜脈注射用藥，不便于多次用藥，以及血栓性疾病的防治，臨床迫切需要預(yù)防血栓病的新藥。r-Sak分子量小，纖溶活性高，對(duì)富含血小板的陳舊性血栓的溶化效果明顯強(qiáng)于其他溶栓藥。 纖溶酶原(Plg)的激活過(guò)程在纖溶系統(tǒng)里是一個(gè)非常關(guān)鍵的反應(yīng)，它導(dǎo)致血栓的溶解，促進(jìn)細(xì)胞遷移和組織重塑。最近，對(duì)uPlg和Sak以及Sk的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)解析為闡明細(xì)菌來(lái)源的纖溶酶

3、原激活劑的作用機(jī)制掃清了障礙。研究發(fā)現(xiàn)Sak和Sk作為輔因子與Plg的特定表位結(jié)合后，加強(qiáng)了后者與底物結(jié)合的能力，并且同時(shí)改變了Plm的底物特異性以及抑制物特異性。 近年來(lái)，基于結(jié)構(gòu)的合理設(shè)計(jì)與基于功能的篩選進(jìn)行生物大分子模擬肽研究倍受重視，并已取得令人鼓舞的成果。如美國(guó)加州Affymax研究所D0werWJ領(lǐng)導(dǎo)的小組應(yīng)用隨機(jī)肽庫(kù)親和篩選的方法，成功地將EPO(分子量34kD，166a.a.)縮小為20個(gè)殘基的環(huán)肽，仍具有EPO

4、的活性。比利時(shí)C01lenD小組應(yīng)用隨機(jī)肽庫(kù)研究了Sak突變體與P1g之間的相互作用，但國(guó)際上迄今未見(jiàn)從模擬肽水平研究?jī)烧咦饔玫膱?bào)道。另一方面，許多蛋白酶由于參予生物體內(nèi)多種生理、病理過(guò)程，成為疾病研究和治療的靶點(diǎn)，結(jié)合噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)，可以找到與某一特定蛋白酶相作用的多肽類(lèi)配體，進(jìn)而研究其作用機(jī)制，為新藥的開(kāi)發(fā)提供先導(dǎo)化合物或直接作為抑制劑進(jìn)入臨床前研究。 葡激酶(Staphylokinase，Sak)為金黃色葡萄球菌(Stap

5、hvlococcusaureus)溶原性噬菌體合成的一種蛋白質(zhì)，與纖溶酶原(Plasminogen，Plg)形成1：l的復(fù)合物Sak-Plg后，受血塊表面痕量纖溶酶Plm)催化，形成Sak-Plm，導(dǎo)致其中Plm的底物特異性改變，成為高效的纖溶酶原激活劑，激活另一分子Plg形成纖溶酶，催化纖維蛋白水解，使血栓溶解，血管再通。由于Sak本身并不是酶，它與Plg結(jié)合后改變Ph的底物特異性而發(fā)揮作用，同時(shí)，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)大腸桿菌表達(dá)的Sak

6、形成包涵體，經(jīng)強(qiáng)變性劑如6M鹽酸胍或8M尿素溶解后，仍然有纖溶活性，這表明：Sak是一種輔因子(cofactor).在發(fā)揮纖溶活性時(shí)對(duì)結(jié)構(gòu)的要求并不嚴(yán)格，很可能只需要Sak分子中維持一定構(gòu)象的肽段或模擬肽，即可發(fā)揮Sak的功能；因此，我們以微小纖溶酶原(micro-Plasminogen，uplg)為靶分子，應(yīng)用隨機(jī)肽庫(kù)進(jìn)行Sak模擬肽的篩選，再利用計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)和結(jié)構(gòu)與功能信息處理，可望獲得模擬S狄功能的多肽類(lèi)溶栓劑，不但可用于血

7、栓病的急救與預(yù)防，而且可能進(jìn)一步發(fā)展為模擬肽和化學(xué)合成類(lèi)的小分子溶栓防栓藥物。 利用絲狀噬菌體表面展示的隨機(jī)肽庫(kù)篩選與uPlg有高親和力的多肽，我們得到了“CSPDASRLC”和“ANQHHKHHHPHF”兩個(gè)序列，它們分別來(lái)源于由二硫鍵限制構(gòu)象的7肽庫(kù)和沒(méi)有構(gòu)象限制的12肽庫(kù)。對(duì)這兩個(gè)序列進(jìn)行合成后分別測(cè)定其水解纖維蛋白的活性發(fā)現(xiàn)，二者僅顯示有微弱的活性，且前者的活性高于后者。在此基礎(chǔ)上，對(duì)序列“CSPDASRLC”進(jìn)行結(jié)構(gòu)改

8、造，將該序列融合表達(dá)于水蛭素的32—36位1.00p區(qū)，由于野生型水蛭素的1.00p32-36伸展在水蛭素與凝血酶的作用面之外，是一個(gè)非常典型的β—Tum結(jié)構(gòu)，這使得該插入序列具有較好的溶液可及性，增加了該模擬肽的溶解性，進(jìn)一步限制了分子自由度，提高了其構(gòu)象穩(wěn)定性，并且該序列的插入不影響水蛭素本身抑制凝血酶的活性。成為一類(lèi)III型模擬肽分子。通過(guò)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了該模擬肽的生物表達(dá)，純化后分別利用發(fā)色底物法和凝膠牛奶板溶圈法檢測(cè)其

9、水解纖維蛋白的活性，發(fā)現(xiàn)新的模擬肽分子具有較為明顯的溶栓活性，相比原來(lái)的從隨機(jī)肽庫(kù)直接篩選得到的多肽分子，新的Sak模擬肽的活性提高了約100一200 倍；并且由于結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，大大提高了其生物利用度，可望在其基礎(chǔ)上通過(guò)結(jié)構(gòu)改造進(jìn)一步提高其活性。 水蛭素(Himdin)是從水蛭中提取的一種抗凝血蛋白質(zhì)。1955年，M盯kwamt指出這種抗凝血物質(zhì)為蛋白質(zhì)，定名為水蛭素；1986年后基因重組水蛭素研究工作蓬勃開(kāi)展，先后有瑞士C

10、iba—Geigy、德國(guó)Hoechst、法國(guó)Transgene公司的重組水蛭素問(wèn)世。水蛭素含有65—66個(gè)氨基酸殘基，為單鏈蛋白結(jié)構(gòu)，分子內(nèi)含3對(duì)二硫鍵。根據(jù)其N(xiāo)-端氨基酸及結(jié)構(gòu)差異可分為HVl、HV2、HV3等突變體類(lèi)型。水蛭素與凝血酶結(jié)合比例為1：1，水蛭素分子有超過(guò)40％的結(jié)構(gòu)與凝血酶緊密結(jié)合，結(jié)合區(qū)域覆蓋了凝血酶分子中纖維蛋白原識(shí)別區(qū)及切割區(qū)(活性區(qū))，水蛭素N端致密區(qū)抑制凝血酶活性區(qū)，C端疏松區(qū)抑制凝血酶識(shí)別區(qū)，其凝血酶抑制常

11、數(shù)達(dá)10-11-10-14，抗凝活力極強(qiáng)。目前，國(guó)內(nèi)尚無(wú)此類(lèi)產(chǎn)品，在國(guó)外已上市的有Hoechst公司的重組水蛭素產(chǎn)品(1epimdin，商品名Renudon，1997年德國(guó)HMR公司的重組水蛭素Renudan(R)(L印imdin)在歐洲獲準(zhǔn)上市，98年5月獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn))，用于治療對(duì)肝素過(guò)敏的患有肝素誘導(dǎo)血小板減少病癥(mT)的病人的抗血栓治療。另外，瑞士Novartis公司的重組水蛭素產(chǎn)品Desimdin在用于全髖置換術(shù)患者預(yù)防

12、血栓栓塞并發(fā)癥方面也有了確切的療效。臨床上，重組水蛭素多用于治療不穩(wěn)定性心絞痛(USA)、急性心肌梗死(AMI)、血管成形術(shù)、術(shù)后血栓形成、血液透析、體外循環(huán)、彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)等。水蛭素及其突變體己經(jīng)在臨床得到應(yīng)用，臨床實(shí)驗(yàn)表明水蛭素不引起過(guò)敏、免疫反應(yīng)，并且不會(huì)造成循環(huán)功能障礙。 由于水蛭素本身就是一種抗凝藥物，融合于水蛭素Loop32-36的Sak模擬肽因?yàn)椴挥绊懰嗡嘏c凝血酶的作用而兼有抗凝和溶栓兩種功能，可同時(shí)

13、從兩種途徑抑制體內(nèi)血栓的形成；此外，由于臨床實(shí)驗(yàn)表明水蛭素不引起過(guò)敏、免疫反應(yīng)，該Sak模擬肽可望解決困擾Sak進(jìn)入臨床用藥的免疫原性過(guò)高、易引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的問(wèn)題。 該Sak模擬肽分子量約為野生型S狄的一半，可以通過(guò)畢赤酵母大量表達(dá)并純化；其分子結(jié)構(gòu)與Sak和Sk完全不同，證明了通過(guò)模擬Sak或Sk等細(xì)菌來(lái)源的纖溶酶原激活劑分子與Plg分子所形成的復(fù)合物特定部位的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，可以開(kāi)發(fā)出新型的纖溶酶原激活劑作為新一代的溶栓和防栓藥物。