雙功能葡激酶突變體（RGD-Sak，DGR）的中試研究及其PLGA緩釋微球的研制.pdf

本實(shí)驗(yàn)室在基因工程葡激酶(Sak)研究的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了新型葡激酶突變體(RGD—Sak，DGR)，它不但保持了野生型葡激酶的溶栓活性，而且具有明顯的抗血小板聚集的功能，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了DGR具有溶栓和抗栓等藥理學(xué)效用。此外，與野生型Sak相比，DGR在豚鼠體內(nèi)的免疫原性明顯下降。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)行了DGR中試規(guī)模的表達(dá)與純化工藝研究。DGR免疫原性低，有望成為預(yù)防血栓性疾病的藥物。但是，DGR與Sak一樣，分子量小，體內(nèi)半衰期短，靜脈用藥不宜于作為預(yù)防性藥物。緩釋微球載藥系統(tǒng)可克服這一缺點(diǎn)。因此，研究具有緩釋功能的DGR微球制劑具有重要應(yīng)用價(jià)值，我們首次研制了葡激酶突變體緩釋微球制劑。 利用DGR工程菌在30L發(fā)酵罐中，高效表達(dá)DGR，表達(dá)產(chǎn)物約占菌體總蛋白的50％。離心收集菌體，用高壓勻漿法破碎菌體，離心后上清用硫酸銨分級(jí)沉淀，沉淀的蛋白溶解后經(jīng)凝膠過(guò)濾和陰離子交換純化，得到高純度、高活性的DGR半成品。加入輔劑、無(wú)菌過(guò)濾、分裝和冷凍干燥后得成品。純化后的產(chǎn)品純度經(jīng)SDS—PAGE、LC-MS、等電聚焦分析，純度在98％以上，比活性為1．2×105AU／mg，每升發(fā)酵液可獲得DGR220mg，純化活性收率在45％以上。中試工藝具有操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、回收率高的優(yōu)點(diǎn)，易于放大至生產(chǎn)規(guī)模。我們初步建立了中試產(chǎn)品的制造和檢定規(guī)程。 使用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備了含DGR的PLGA微球，研究了攪拌速度、PLGA濃度、內(nèi)水相和外水相中的添加劑對(duì)蛋白包封率以及微球性質(zhì)的影響。并進(jìn)行了DGR微球的體外和體內(nèi)釋放試驗(yàn)。為了提高DGR在包封過(guò)程中的穩(wěn)定性，研究了DGR水溶液與二氯甲烷形成乳液時(shí)，吐溫一80、聚乙二醇、甘露醇、蔗糖和聚乙烯醇(PVA)對(duì)DGR穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)吐溫一80、聚乙二醇、甘露醇、蔗糖均不能提高DGR的回收率；只有PVA有效抑制超聲乳化時(shí)DGR在水／二氯甲烷界面上的變性，使DGR的活性回收率從16％提高到幾乎90％以上，并且PVA對(duì)DGR的保護(hù)作用呈現(xiàn)量效關(guān)系。在外水相中加入NaCl可以顯著提高蛋白包封率，同時(shí)使微球表面的孔洞變小，微球內(nèi)DGR的分布更加均勻。DGR微球的體內(nèi)、外釋放呈現(xiàn)兩個(gè)時(shí)相，即突釋期和隨后的緩釋期，DGR體外以活性形式釋放可達(dá)到15天以上；肌肉注射微球后，DGR在兔體內(nèi)緩釋釋放達(dá)到5天以上。我們的試驗(yàn)結(jié)果表明，PLGA微球是DGR的良好載藥系統(tǒng)。 DGR從微球中的釋放不完全，我們對(duì)PLGA微球釋放過(guò)程中造成DGR變性聚集的因素進(jìn)行了分析發(fā)現(xiàn)，PLGA降解產(chǎn)物產(chǎn)生的微球內(nèi)酸性微環(huán)境會(huì)導(dǎo)致DGR的變性聚集。內(nèi)水相中加入Mg(OH)2可減少DGR變性，提高DGR穩(wěn)定性。此外PLGA的表面吸附也是DGR釋放不完全的重要原因。 用傅里葉變換紅外光譜法(FT-IR)定量研究了PLGA微球內(nèi)DGR的二級(jí)結(jié)構(gòu)。將可增強(qiáng)分辨率的傅里葉去卷積技術(shù)與高斯曲線擬合技術(shù)共同用于微球內(nèi)DGR酰胺工帶的定量分析，發(fā)現(xiàn)DGR酰胺I帶共包含九個(gè)紅外吸收峰，并對(duì)各組份進(jìn)行了歸屬，還對(duì)微球內(nèi)DGR結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性相關(guān)的1623和1650cm-~吸收峰進(jìn)行了討論。