Cyclin D3與elF3k的相互作用及TH1與A-Raf相互作用的研究.pdf

1、在細胞周期的調控過程中,有兩大家族的蛋白發(fā)揮著重要的作用.一個家族是CDK,它們磷酸化特異的蛋白來調節(jié)下游通路.另一個家族是專門的調節(jié)蛋白cyclins,它們與CDK分子結合來調節(jié)CDK的激酶活性.當細胞從靜止期進入細胞分裂時,編碼D型cyclin的基因在G1期被激活,cyclin D隨之與CDK4或CDK6形成一個復合物,活化后的激酶復合物磷酸化底物蛋白調控下游的通路.在cyclin D中,cyclin D3不僅作為一個CDK4和CD

2、K6的調節(jié)亞基在G1期調節(jié)細胞周期進程,還與細胞生長、細胞分化、轉錄調節(jié)和凋亡有關.我們實驗室報導了一個G2/M期的CDK-CDK11<'P58>,也能特異地與cyclin D3在G2/M期相互作用.為了進一步了解cyclin D3在細胞里的功能,我們以cyclin D3為誘餌蛋白,用酵母雙雜交技術篩選人胎肝cDNA文庫,找到了與cyclin D3結合的蛋白eIF3k(真核翻譯起始因子3的p28亞基).cyclin D3與eIF3k的相

3、互作用是特異性的,因為我們沒有檢測到eIF3k與其它cyclin D的相互作用.我們構建了cyclin D3的缺失突變體,用酵母雙雜交的方法明確了cyclin D3與eIF3k相互結合所需的區(qū)域位于cyclin D3的第154-292氨基酸之間,這一區(qū)域是cyclin D同源性最低的部位.我們進一步用體外結合實驗、體內的免疫共沉淀和激光共聚焦確定了cyclin D3和eIF3k的相互作用.激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現eIF3k分布于細胞質和

4、細胞核中,cyclin D3與eIF3k在細胞內不僅具有共定位,而且過表達cyclin D3會影響eIF3k在細胞中的分布,使更多的eIF3k蛋白集中在細胞核中.過表達eIF3k會抑制細胞的翻譯活性,而過表達cyclin D3則會增強細胞的翻譯活性,同時轉錄水平不受影響.這為我們進一步理解cyclin D3和eIF3k在細胞中可能的的功能提供了有益的線索.細胞通過信號傳導通路將來自細胞外各種刺激傳導入細胞核內,調節(jié)基因的表達,從而使細胞

5、產生增殖、分化、凋亡等生命活動.在我們實驗室以前的的工作中,采用酵母雙雜交的方法,以A-Raf為誘餌蛋白篩選了人胎肝cDNA文庫,發(fā)現了一個與A-Raf相互作用的蛋白trihydrophobin 1(TH1).TH1是2000年克隆的一個新基因,對于它的功能方面還沒有研究.該實驗中對TH1與A-Faf的相互作用進行了進一步的研究.在GST pull-down實驗中驗證了TH1與A-Raf的相互作用,并通過酵母共轉化和GST pull-d

6、own發(fā)現TH1蛋白N端1-392氨基酸的區(qū)域對于這種結合是至關重要的.激光共聚焦顯微鏡觀察也證實了TH1與A-Raf在細胞內的共定位.我們的實驗還表明TH1與A-Raf的相互作用是特異性的,因為TH1與Raf家族的另兩個成員B-Raf和c-Raf不能相互作用.另外,激光共聚焦結果顯示,TH1和A-Faf的相互作用并不僅僅局限于細胞質和細胞膜上,而通過對TH1蛋白結構域分析,我們發(fā)現其似乎不具有激酶結構域,推測有可能是一種新的構架蛋白.