CYP11B1基因新突變致11β-OHD一例家系研究.pdf

1、研究背景:先天性腎上腺增生癥（congenital adrenal hyperplasia，CAH）是一組由于控制腎上腺皮質(zhì)醇和皮質(zhì)酮合成的各種酶缺乏導(dǎo)致的常染色體隱性遺傳疾病。CAH患者根據(jù)不同的酶缺陷而有非常廣泛的臨床表現(xiàn)譜，這些酶包括21-羥化酶，11β-羥化酶，3β-羥類固醇脫氫酶，17α-羥化酶等[1]。11β-羥化酶缺陷癥(11β-hydroxylase deficiency，11β-OHD)是CAH的第二大原因，占CAH5

2、-8％，在非近親結(jié)婚人群中發(fā)病率約為1:100000-1:200000[2]。11β-OHD根據(jù)臨床癥狀嚴重程度及酶活性的缺陷程度分為經(jīng)典型和非經(jīng)典型。典型的11β-OHD引起特征性的皮質(zhì)醇合成減少。皮質(zhì)醇缺乏反饋性增加促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)增加，引起腎上腺皮質(zhì)增生，伴隨類固醇前體物質(zhì)增加，從而促進雄激素合成通路亢進。過多的腎上腺來源雄激素導(dǎo)致女性男性化、假兩性畸形、男性假性性早熟。皮質(zhì)酮通路受阻導(dǎo)致11-去氧皮質(zhì)酮(11-Deo

3、xycorticosterone，DOC)及其代謝物積聚，這些物質(zhì)具有鹽皮質(zhì)激素活性，從而導(dǎo)致鈉潴留及容量擴張[3]。
　　編碼11β-羥化酶的基因CYP11B1位于8q24.3，包含9個外顯子。該基因長5.4kb，功能上與合成醛固酮(ALD)的CYP11B2基因相似。這兩個基因具有95％的序列同源性，相距約40kb。與21-羥化酶患者中基因型與表型具有良好的相關(guān)性不同，在11β-OHD患者中很難預(yù)測突變對酶活性及臨床表型的影響，

4、這與11β-OHD患者數(shù)量較少，難以形成大規(guī)模研究有關(guān)[4]。但是， CYP11B1基因分析可以協(xié)助確診11β-OHD以及有助于遺傳咨詢。
　　研究目的:本研究采集了一例高血壓伴低血鉀患者，明確患者為經(jīng)典型11β-OHD。對患者及其家系進行CYP11B1基因分析，發(fā)現(xiàn)了一種剪接突變。利用實時熒光定量PCR技術(shù)明確患者遺傳形式;利用小基因技術(shù)，通過質(zhì)粒構(gòu)建體外表達mRNA，明確該剪接突變對mRNA的影響。
　　研究方法:通過實

5、驗室及影像學檢查結(jié)合患者家系資料收集，達到臨床診斷11β-OHD目的。用EDTA抗凝管留取患者及家系外周血，利用試劑盒提取外周血單個核細胞DNA。根據(jù)基因文庫中CYP11B1基因序列，利用軟件primer premier6.0設(shè)計引物分別擴增各個外顯子區(qū)域及外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)域。分別使用患者及父母DNA為模板擴增，目的片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離并純化后，利用ABI3130xl基因測序儀測序，并利用Autoassembler2.0軟件將

6、測序結(jié)果與UCSC數(shù)據(jù)庫下載的基因組序列進行比對，從而找出突變位點。基因測序結(jié)果顯示患者為純合點突變，母親為雜合點突變，父親未發(fā)現(xiàn)突變位點，因此推測患者CYP11B1基因存在父源的大段缺失突變。為此，我們設(shè)計引物通過圍繞基因點突變兩側(cè)擴增，產(chǎn)物為150bp，通過熒光實時定量PCR技術(shù)對該片段拷貝數(shù)定量。此外，由于該突變?yōu)榧艚油蛔儯瑸槊鞔_突變對mRNA剪接的影響，我們利用小基因技術(shù)，通過質(zhì)粒構(gòu)建并導(dǎo)入工程細胞中來體外表達，明確突變對mRN

7、A剪接的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1.臨床診斷:患者臨床確診為經(jīng)典型11β-OHD?；颊呒蚁党蓡T中父親、母親、哥哥、姐姐均表型正常。
　　2.患者及家系突變檢測結(jié)果:(1)Sanger測序顯示患者CYP11B1基因c.595+1G＞A純合形式突變。該突變?yōu)榧艚油蛔儯?jīng)初步生物信息學分析(Augustus)明顯影響mRNA剪接?；颊吣赣H、姐姐攜帶c.595+1G＞A雜合突變，父親該位點未見異常。
　　3.熒光實時