西紅花7，8-二加氧酶基因的克隆及在大腸桿菌中的表達(dá)與檢測(cè).pdf

1、西紅花(Crocus satavus L.)系鳶尾科多年生草本植物，是一種珍貴的藥材，用途廣泛。其柱頭不僅含昂貴的香料和色素，而且含有具有治療作用的生物活性成分。西紅花甙是其中最重要的藥用成分。為了研究西紅花藥用成分西紅花甙的資源，更好地利用西紅花甙，本論文對(duì)西紅花進(jìn)行了分子生物學(xué)方面的研究：對(duì)西紅花酸合成酶(7，8-二加氧酶)基因的克隆，并將其在大腸桿菌中表達(dá)，純化誘導(dǎo)蛋白，制備相應(yīng)的特異性抗體。 西紅花酸合成酶(7，8-二加

2、氧酶)是西紅花柱頭中西紅花甙生物合成途徑中的關(guān)鍵酶。根據(jù)已發(fā)表西紅花酸合成酶基因序列設(shè)計(jì)PCR特異性引物，從西紅花柱頭總RNA中擴(kuò)增并克隆到一段長(zhǎng)為1.2kb的片段。將該片段連接到pMD18-T載體上。挑選幾個(gè)克隆測(cè)序，結(jié)果表明該片段含有兩個(gè)序列。一個(gè)與已知西紅花酸合成酶基因序列高度同源(同源性99％)，命名為CsZCD。另一個(gè)的同源性為96％，命名為CsZCD-new。Southem雜交顯示有兩條雜交帶。 為了擴(kuò)大西紅花甙來(lái)源

3、和尋找新的資源，本研究將克隆到的西紅花酸合成酶基因CsZCD和CsZCD-new分別克隆到表達(dá)載體pQE31上，得到重組質(zhì)粒pQE31-CsZCD和pQE31-CsZCD-new。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli M15，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)出了N端融合了6×His的融合蛋白，其表達(dá)量分別占菌體總蛋白的13.7％和14.4％。SDS-PAGE和Western blot分析表明，表達(dá)產(chǎn)物的分子量約為49kD和52kD。融合蛋白以包涵體的

4、形式存在，將其變性后經(jīng)HisTrap<'TM> HP柱親和純化，得到純化蛋白，用于制備抗體。用純化蛋白免疫家兔，制得多克隆抗體。抗血清的效價(jià)均達(dá)1：12800。Western blot分析表明，所制得的抗血清只能與CsZCD、CsZCD-new融合蛋白發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)。 用制得的抗血清檢測(cè)梔子未成熟果實(shí)的總蛋白，卻發(fā)現(xiàn)里面并沒(méi)有能與之相結(jié)合的條帶。 本實(shí)驗(yàn)的工作為進(jìn)一步在蛋白質(zhì)水平上研究CsZCD、CsZCD-new