牙鲆變態(tài)過程中右眼移動(dòng)的新模型及相關(guān)基因的篩選.pdf

1、在生物發(fā)育中的形態(tài)生成過程中，目前為止人們對(duì)左右軸建立和破壞的機(jī)制的理解仍然非常模糊。左右不對(duì)稱的生物可以成為研究左右對(duì)稱軸建立和破壞的一個(gè)很好的實(shí)驗(yàn)材料。鰈形目魚類(俗稱比目魚類)的變態(tài)，使一只眼睛逐漸地移動(dòng)至頭部的另一側(cè)，在外形上表現(xiàn)出明顯地左右不對(duì)稱。所以，研究鰈形目魚類眼睛移動(dòng)的機(jī)制，對(duì)揭示左右對(duì)稱軸的是如何破壞的一個(gè)極好的研究切入口。 已有解釋鰈形目魚類眼睛移動(dòng)現(xiàn)象的各種假說。Brewst認(rèn)為眼睛移動(dòng)是額骨變形造成的腦

2、顱前部變形，促使眼睛移動(dòng)，然后，通過眼睛移動(dòng)的一側(cè)的側(cè)篩骨的快速擴(kuò)大，進(jìn)一步推動(dòng)眼睛向上移動(dòng)。此假說得到了Wagman、Okada等的支持。此假說是建立在對(duì)骨骼發(fā)育進(jìn)行觀察的基礎(chǔ)上，可能由于技術(shù)上的原因，而忽視了眼睛周圍其他組織的作用。 牙鲆(Paralichthysolivaceus)是目前研究眼睛移動(dòng)現(xiàn)象最為集中的鰈形目魚類，在變態(tài)后，其右側(cè)的眼睛逐漸移至頭部左側(cè)。這里我們利用整體TUNEL方法和整體BrdU的原位檢測(cè)技術(shù)，

3、對(duì)從孵化后13天到43天的仔魚的凋亡細(xì)胞和分裂細(xì)胞的整體分布進(jìn)行了調(diào)查，在眼睛移動(dòng)之前的仔魚(17天)，發(fā)現(xiàn)僅僅在脊髓和脊髓鞘中檢測(cè)到細(xì)胞凋亡，而在其它部位沒有檢測(cè)到任何的細(xì)胞凋亡。在眼睛移動(dòng)之后，在腦顱的一些骨骼、腦、眼睛、內(nèi)耳、冠狀幼鰭基部、尾鰭基部、下頜骨、鰓弓及肝臟中檢測(cè)到細(xì)胞凋亡，初步表明細(xì)胞凋亡雖然與眼睛最初的移動(dòng)沒有直接的關(guān)系，但在牙鲆變態(tài)的其它事件中起作用。在眼睛移動(dòng)之前的13天和17天仔魚的眼睛周圍，則檢測(cè)到細(xì)胞分裂，

4、并且發(fā)現(xiàn)右側(cè)眼睛下方組織中的細(xì)胞分裂信號(hào)，要強(qiáng)于左側(cè)相同的位置上的信號(hào)。在眼睛移動(dòng)之后，發(fā)現(xiàn)在兩只眼睛之間繞過頭背部的區(qū)域出現(xiàn)了不均衡的分裂帶，分裂帶右側(cè)的信號(hào)要強(qiáng)于左側(cè)。隨眼睛進(jìn)一步向上移動(dòng)，分裂帶兩端仍然維持在原來的位置，因此，右側(cè)眼睛由于向上移動(dòng)，使其下方的分裂細(xì)胞的數(shù)量比左側(cè)眼睛下方的分裂細(xì)胞的數(shù)量要明顯多得多，促使眼睛進(jìn)一步向上移動(dòng)。利用硫脲抑制右眼移動(dòng)，發(fā)現(xiàn)，牙鲆的細(xì)胞分裂被完全抑制，而細(xì)胞凋亡則沒有影響，這更直接證明細(xì)胞分

5、裂是驅(qū)使牙鲆右眼開始移動(dòng)的原動(dòng)力。根據(jù)以上的結(jié)果，我們提出了一個(gè)新的解釋鰈形目魚類眼睛移動(dòng)的模型。此模型認(rèn)為，鰈形目魚類眼睛移動(dòng)的驅(qū)動(dòng)力產(chǎn)生于在腦顱骨化之前；哪只眼睛移動(dòng)，取決于左右眼睛下方組織的細(xì)胞分裂的數(shù)量，在眼睛移動(dòng)之后，不均勻的細(xì)胞分裂帶促進(jìn)眼睛進(jìn)一步移動(dòng)。此模型能很好地解釋鰈形目魚類眼睛位置多樣性的現(xiàn)象，與已被摒棄的Giard提出的假說也很類似。 關(guān)于眼睛移動(dòng)的信號(hào)調(diào)控，已經(jīng)有不少的研究。Inui&Miwa首先發(fā)現(xiàn)甲狀

6、腺激素能促進(jìn)眼睛移動(dòng)，但不能確定哪種甲狀腺激素受體參與其中。Hashimoto等已證明牙鲆右眼的移動(dòng)的信號(hào)調(diào)控途徑不同于脊椎動(dòng)物內(nèi)臟左右不對(duì)稱的信號(hào)途徑。因此，到目前為止，還沒有一個(gè)明確的分子與眼睛移動(dòng)有關(guān)。我們利用抑制差減雜交技術(shù)，以眼睛移動(dòng)之前的17天仔魚的頭部RNA為驅(qū)動(dòng)RNA，建立了眼睛開始移動(dòng)的23天仔魚頭部的抑制差減cDNA文庫(kù)，利用相對(duì)定量RTPCR技術(shù)初步篩選陽性克隆，利用整體原位雜交技術(shù)確定基因的時(shí)空表達(dá)模式，對(duì)于與右

7、眼移動(dòng)相關(guān)的候選基因，利用錨定PCR技術(shù)從建立的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)中克隆全長(zhǎng)cDNA。從抑制差減cDNA文庫(kù)克隆到的Sfrs3基因，發(fā)現(xiàn)在眼睛移動(dòng)之后的頭部表達(dá)水平明顯增加，相比胚胎階段，在變態(tài)G階段和H階段的Sfrs3基因表達(dá)水平分別增加了4倍和7倍。在右眼移動(dòng)之前，Sfrs3基因的表達(dá)主要集中在身體的尾部，而很少在頭部表達(dá)，隨右眼進(jìn)一步移動(dòng)，表達(dá)逐漸向頭部集中，在右眼移至接近頭背部時(shí)(G階段)，Sfrs3基因的表達(dá)大部分集中在頭部，而

8、在身體后部基本沒有表達(dá)。對(duì)頭部的橫截面的進(jìn)一步觀察，發(fā)現(xiàn)在右眼移動(dòng)的G階段，Sfrs3基因在右側(cè)側(cè)篩骨和右側(cè)的“thicknessskin”中表達(dá)，尤其是在“thicknessskin”的表達(dá)信號(hào)要明顯強(qiáng)于其周圍的組織，“thicknessskin”的位置位于我們新模型中G階段細(xì)胞分裂帶右眼的下方，同時(shí)，根據(jù)Okada的研究，“thicknessskin”是一個(gè)細(xì)胞快速分裂的組織，逐漸變?yōu)镻seudomesialbar骨骼，推動(dòng)右眼進(jìn)一

9、步向上移動(dòng)。牙鲆Sfrs3基因是一個(gè)含RNA識(shí)別模序(RRM)和一個(gè)絲氨酸／精氨酸豐富的區(qū)域，和人類Sfrs3基因具有很高的同源性，是一個(gè)典型的RNA剪輯輔助因子。另外，人Sfrs3基因已證明參與細(xì)胞分裂周期的調(diào)節(jié)，牙鲆SFRS3很可能在“thicknessskin”的細(xì)胞分裂中起作用。今后需要進(jìn)一步的研究，明確確定牙鲆SFRS3參與牙鲆右眼移動(dòng)。 另外，我們也探討了GAPDH、βactin和18srRNA三種作為RTPCR常用