EIF3D對腎細胞癌惡性增殖的調(diào)控機制研究.pdf

1、背景：
　　腎細胞癌(renal cell carcinoma)是腎惡性腫瘤中最常見腫瘤類型，占泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第三位。隨著腹部影像檢查的普及，越來越多的局限性早期腎癌被發(fā)現(xiàn)，但仍有一部分腎癌發(fā)現(xiàn)時已處于晚期階段。目前，腎癌根治術(shù)是局限性早期腎癌治療的金標準。然而術(shù)后仍有部分患者出現(xiàn)腫瘤的復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移，其潛在的機制仍未知。盡管近年來的分子生物和靶向VEGFR治療的發(fā)展給晚期進展性腎細胞癌帶來了希望，但是大約有50％的患者對

2、靶向治療不敏感，或者有大部分患者在服藥后1年左右對靶向藥物產(chǎn)生耐受。因此探索腎細胞癌治療的新靶點，增加對腎細胞癌發(fā)生發(fā)展的潛在分子機制的認識，進而為臨床腎細胞癌的早期診斷及預(yù)后提供依據(jù)，已成為泌尿外科的重要研究熱點。
　　EIF3D是翻譯起始因子的主要成員。作為一個相對較新的分子，目前研究報道較少，且大多僅限于腫瘤表型的研究。研究表明，EIF3D與惡性腫瘤細胞的抗凋亡相關(guān)，敲除EIF3D基因能夠抑制間皮瘤細胞的惡性增殖。通過丁型肝

3、炎病毒感染HEK-293細胞后檢測蛋白質(zhì)組的變化，發(fā)現(xiàn)EIF3D表達上調(diào)，指出EIF3D與肝癌的發(fā)生有關(guān)。也有報道表明EIF3D和腸癌、黑色素瘤以及膠質(zhì)瘤的惡性增殖有關(guān)，但尚未對其下游機制進行深入探討。在腎細胞癌中，EIF3D的功能作用尚未闡明。為了進一步闡釋EIF3D在腎細胞癌惡性增殖的作用機制，我們采用基因數(shù)據(jù)庫、配對新鮮腎細胞癌組織、腎細胞癌組織微陣列檢測EIF3D在腎細胞癌組織中的mRNA和蛋白表達水平。隨后應(yīng)用慢病毒介導敲減模

4、型在腎細胞癌細胞株中沉默EIF3D后，進行一系列腫瘤細胞生物學特性及其下游機制的研究。
　　目的：
　　探索EIF3D在腎細胞癌組織中表達水平和對腎細胞癌細胞的生物學特性影響及其分子機制。
　　方法：
　?。ㄒ唬┰谀I細胞癌新鮮組織、腎細胞癌組織切片及基因數(shù)據(jù)庫中檢測EIF3D的mRNA和蛋白的表達水平。
　　于2015年1月至2015年6月在上海長征醫(yī)院泌尿外科收集20對新鮮組織腎細胞癌組織標本。所有標本通

5、過兩種途徑保存:1、制成免疫組化檢測玻片;2、新鮮組織液氮保存。102例腎細胞癌患者組織微陣列芯片由上海市長海醫(yī)院泌尿外科贈送。以上組織標本通過免疫組化和蛋白印跡法(Western Blot)檢測EIF3D的蛋白表達水平，并分析與臨床指標的相關(guān)性。應(yīng)用ONCOMINE基因數(shù)據(jù)庫分析EIF3D在腎細胞癌的mRNA表達水平及與臨床指標的相關(guān)性。
　?。ǘ?gòu)建沉默EIF3D慢病毒載體和刷選穩(wěn)定沉默EIF3D的腎細胞癌細胞株
　

6、　設(shè)計靶向EIF3D的shRNA序列，插入含綠色熒光報告基因(GFP)的質(zhì)粒中，構(gòu)建穩(wěn)定沉默EIF3D的慢病毒載體。應(yīng)用蛋白免疫印跡方法檢測6種腎細胞癌細胞株中EIF3D的表達水平，挑選2株高表達EIF3D細胞株作為穩(wěn)定沉默EIF3D的候選細胞株。將已重組的沉默EIF3D的慢病毒感染這2株腎細胞癌細胞，通過綠色熒光表達情況判斷感染效率，利用Real-time PCR和Western Blot檢測EIF3D的敲減效率。
　?。ㄈ?/p>

7、檢測穩(wěn)定沉默EIF3D腎細胞癌細胞株的細胞增殖和細胞克隆的腫瘤生物學特征的改變情況
　　在穩(wěn)定沉默EIF3D的腎細胞癌細胞株的基礎(chǔ)上，采用MTT實驗和克隆形成實驗，檢測穩(wěn)定沉默EIF3D細胞株的細胞增殖情況和單細胞克隆形成情況。
　?。ㄋ模⑻剿鞒聊珽IF3D后影響腎細胞癌細胞惡性增殖的分子機制
　　利用流式細胞分選技術(shù)檢測定沉默EIF3D的腎細胞癌細胞株的細胞周期分布情況，進行統(tǒng)計分析。再通過Western Blot

8、檢測和ONCOMINE基因數(shù)據(jù)庫分析影響細胞周期分布的調(diào)控分子，闡釋其分子機制。
　　結(jié)果：
　?。ㄒ唬┰谀I細胞癌組織中EIF3D的蛋白表達水平上調(diào)
　　通過蛋白免疫印跡方法檢測新鮮腎細胞癌與配對癌旁組織，發(fā)現(xiàn)腎細胞癌中EIF3D蛋白表達水平顯著上調(diào)(P=0.005)。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，腎細胞癌組織標本染色較癌旁組織明顯加深，且陽性細胞數(shù)目增多，存在顯著差異(P＜0.001)。
　?。ǘ〦IF3D的表達水平與腎

9、細胞癌患者的臨床特征成正相關(guān)
　　腎細胞癌組織微陣列芯片檢測發(fā)現(xiàn)EIF3D表達水平與腫瘤大小(P=0.004)和TNM分期（P=0.03）呈顯著地正相關(guān)，且隨著EIF3D染色密度加深，TNM分期不斷增加。
　?。ㄈ├肙NC OMINE微陣列芯片數(shù)據(jù)庫進行EIF3D在腎細胞癌與正常腎組織的mRNA表達水平的薈萃分析
　　對5個腎細胞癌基因芯片數(shù)據(jù)庫進行薈萃分析，EIF3D的mRNA表達水平在腎透明細胞癌中較正常腎組織

10、顯著上調(diào)(P=0.004)。通過對腎細胞癌亞型分析發(fā)現(xiàn)，惡性程度較高的腎透明細胞癌（CCRCC）和腎乳頭狀細胞癌(PRCC)的EIF3D表達水平較惡性程度較低腎嫌色細胞癌(CRCC)上調(diào)(P=0.002;P=0.010)。
　?。ㄋ模┰谀I細胞癌細胞株中通過慢病毒介導穩(wěn)定敲減EIF3D基因
　　Western Blot檢測腎細胞癌細胞株，786-O和ACHN細胞株的EIF3D表達水平較其他細胞株上調(diào)。786-O和ACHN細胞株

11、感染慢病毒介導的shRNA沉默EIF3D，Real-time PCR和Western Blot驗證敲減效率，穩(wěn)定沉默EIF3D細胞株模型成功建立。
　?。ㄎ澹〦IF3D沉默顯著抑制腎細胞癌細胞的增殖和克隆形成能力
　　786-O和ACHN細胞在沉默EIF3D后，細胞生長曲線顯著抑制較對照組(P＜0.001)。克隆大小在沉默組和對照組顯著存在差異，且沉默組的克隆數(shù)量顯著少于對照組(786-O:P=0.0002;ACHN:P＜0

12、.0000)。
　　（六）EIF3D沉默誘導腎細胞癌細胞G2/M期阻滯
　　786-O和ACHN細胞在沉默EIF3D后，利用流式細胞分選技術(shù)發(fā)現(xiàn)EIF3D沉默組G2/M期細胞較對照組顯著上調(diào)，同時sub-G1期的細胞累積。為了驗證G2/M期阻滯的相關(guān)分子機制，Western Blot檢測周期相關(guān)下游分子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默組周期相關(guān)蛋白CDK1和Cyclin B1蛋白表達水平下調(diào)，凋亡相關(guān)蛋白p21和RARP裂解產(chǎn)物上調(diào)。通過ON

13、COMINE基因數(shù)據(jù)庫分析，EIF3D的表達水平與Cyclin B1(r2=0.2354，P＜0.0001)and CDK1(r2=0.1332，P=0.0003)呈現(xiàn)正相關(guān)，同時與增殖相關(guān)分子標志物PCNA(r2=0.1687，P＜0.0001)呈現(xiàn)正相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1、EIF3D在腎細胞癌組織中顯著上調(diào)，且與TNM分期呈正相關(guān)。
　　2、EIF3D沉默誘導腎細胞癌細胞G2/M期阻滯通過下調(diào)CyclinB1/