1,25-二羥維生素D3對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖活性的影響及其表觀遺傳調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的:通過(guò)1，25-二羥維生素D3(1，25(OH)2D3)處理人表皮角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞后，檢測(cè)HaCaT細(xì)胞增殖活性、基因組總體甲基化水平、DNA甲基化修飾相關(guān)基因表達(dá)水平、細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)基因PDCD5和TIMP2表達(dá)及其啟動(dòng)子甲基化水平的變化，初步揭示維生素D3治療銀屑病的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制，為尋找銀屑病治療的新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:1.HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。接種細(xì)胞融合

2、達(dá)70％，培養(yǎng)基中分別加入10-6M、10-7M、10-8M的1，25(OH)2D3處理細(xì)胞24小時(shí);
　　 2.使用MTT細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)不同濃度1，25(OH)2D3對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖活性的影響;
　　 3.不同濃度1，25(OH)2D3處理HaCaT細(xì)胞后，基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)胞基因組DNA，Trizol法提取細(xì)胞總RNA;
　　 4.應(yīng)用整體甲基化定量試劑盒檢測(cè)1，25(OH)2D3組和陰性對(duì)照

3、組HaCaT細(xì)胞基因組DNA總體甲基化水平;
　　 5.實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitativereal-timePCR，RT-qPCR)檢測(cè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltransferases，DNMTs)、甲基結(jié)合蛋白(MethylBindingDomainProteins，MBDs)、PDCD5和TIMP2的mRNA水平;
　　 6.甲基化特異性PCR(methylation-specificPCR，

4、MS-PCR)檢測(cè)PDCD5和TIMP2的啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平。
　　 結(jié)果:1.與陰性對(duì)照組比較，10-6M1，25(OH)2D3處理組HaCaT細(xì)胞增殖活性及DNA整體甲基化水平明顯降低(P＜0.05)。
　　 2.Real-timePCR結(jié)果顯示:與陰性對(duì)照組相比，HaCaT細(xì)胞甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1基因mRNA水平在10-6M和10-7M濃度1，25(OH)2D3處理組無(wú)明顯改變。然而甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3a和D

5、NMT3bmRNA較對(duì)照組轉(zhuǎn)錄水平明顯下降，其中DNMT3a在10-6M組改變具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。甲基結(jié)合蛋白MeCP2與MBD2在各濃度組mRNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào)(P＜0.05)。MBD1基因在10-6M組mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)(P＜0.05)，10-7M組轉(zhuǎn)錄下調(diào)不明顯。MBD3、MBD4mRNA在10-6M組無(wú)明顯差異，但MBD3基因mRNA在10-7M組明顯上調(diào)(P＜0.05)。DNMTs和MBDs基因mRNA水

6、平在低濃度10-8M濃度組表達(dá)水平均顯著升高(P＜0.05)。
　　 3.Real-timePCR結(jié)果顯示:與陰性對(duì)照組相比，PDCD5和TIMP2mRNA轉(zhuǎn)錄水平在10-6M濃度組明顯上調(diào)(P＜0.05)。MS-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:與陰性對(duì)照組相比，PDCD5和TIMP2基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平明顯降低(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:1，25(OH)2D3通過(guò)抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT3a和DNMT3b的表達(dá)，